內(nèi)毒素耐受幼鼠肝臟Myd88及ToIIop蛋白表達(dá)變化的研究.pdf

1、目的:建立內(nèi)毒素耐受幼鼠模型，研究?jī)?nèi)毒素耐受幼鼠肝臟組織TLR4（Toll樣受體4）/Myd88通路上正性因子髓樣分化蛋白88(Myeloid differentiation factor88，Myd88)及負(fù)性因子Toll反應(yīng)蛋白（Tollinteracting protein，Tollip）的表達(dá)情況。
　　方法:1、實(shí)驗(yàn)分組:將96只ICR幼鼠（日齡40±2天）隨機(jī)分為3組，每組32只幼鼠。第一組為實(shí)驗(yàn)組（預(yù)先刺激組），第二

2、組為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（非預(yù)先刺激組），第三組為空白對(duì)照組。2、建立內(nèi)毒素耐受模型:(1)采用腹腔注入脂多糖的方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)組幼鼠經(jīng)腹腔注入0.5mg/kg脂多糖，對(duì)實(shí)驗(yàn)對(duì)照組及空白對(duì)照組幼鼠經(jīng)腹腔注入等容量的生理鹽水。(2)24小時(shí)后對(duì)實(shí)驗(yàn)組及實(shí)驗(yàn)對(duì)照組幼鼠經(jīng)腹腔注入5mg/kg脂多糖，對(duì)空白對(duì)照組幼鼠經(jīng)腹腔注入等容量的生理鹽水。3、指標(biāo)檢測(cè):(1)分別在第二次注射0h(第二次注射前)，3h，8h，24h每組隨機(jī)選取幼鼠8只，采用眼球摘除法取幼

3、鼠外周血，分離血清，采用酶聯(lián)免疫分析法檢測(cè)各組各時(shí)間點(diǎn)幼鼠血清晚期細(xì)胞因子高遷移率組蛋白B-1（High mobility group protein B-1，HMGB-1）的表達(dá)情況。(2)取血后在無(wú)菌操作下取幼鼠肝臟組織，并放在4％多聚甲醛固定液中保存，石蠟固定切片，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組各時(shí)間點(diǎn)幼鼠肝臟Myd88及Tollip蛋白的表達(dá)情況，同時(shí)觀察病理改變。
　　結(jié)果:1、幼鼠行為變化:小劑量及大劑量脂多糖刺激后幼鼠均

4、出現(xiàn)少吃、少喝、少動(dòng)、嗜睡及毛發(fā)散亂等表現(xiàn)，大劑量脂多糖刺激后上訴癥狀尤為明顯，生理鹽水刺激后幼鼠無(wú)明顯變化。2、幼鼠血清HMGB-1表達(dá)情況:(1)對(duì)第二次注射0h、3h幼鼠血清HMGB-1表達(dá)量進(jìn)行組間比較，各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，P0h=0.686、P3h=0.356)。(2)對(duì)第二次注射8h、24h幼鼠血清HMGB-1表達(dá)量進(jìn)行組間比較，實(shí)驗(yàn)組幼鼠血清HMGB-1表達(dá)量明顯低于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜

5、0.05)，提示內(nèi)毒素耐受模型建立成功;實(shí)驗(yàn)組及實(shí)驗(yàn)對(duì)照組幼鼠血清HMGB-1表達(dá)量均明顯高于空白對(duì)照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(3)在實(shí)驗(yàn)組及實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中幼鼠血清HMGB-1出現(xiàn)表達(dá)的時(shí)間在第二次注射3h-8h時(shí)刻之間，在24h時(shí)刻時(shí)表達(dá)并未恢復(fù)至原有基礎(chǔ)水平。3、實(shí)驗(yàn)組幼鼠肝臟組織病理?yè)p傷明顯輕于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，進(jìn)一步提示內(nèi)毒素耐受模型建立成功。4、幼鼠肝臟組織Myd88表達(dá)情況:(1)對(duì)第二次注射前0h幼鼠肝臟組織My

6、d88表達(dá)量進(jìn)行組間比較，各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，P0h=0.956)。(2)對(duì)第二次注射3h、8h幼鼠肝臟組織Myd88表達(dá)量進(jìn)行組間比較，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組幼鼠肝臟組織Myd88表達(dá)量高于實(shí)驗(yàn)組及空白對(duì)照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組幼鼠肝臟組織Myd88表達(dá)量高于空白對(duì)照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(3)對(duì)第二次注射24h幼鼠肝臟組織Myd88表達(dá)量進(jìn)行組間比較，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組幼鼠肝臟組織Myd8

7、8表達(dá)量高于實(shí)驗(yàn)組及空白對(duì)照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組幼鼠肝臟組織Myd88表達(dá)量與空白對(duì)照組比較，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，P24h=0.08)。(4)在實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中幼鼠肝臟組織Myd88的表達(dá)在第二次注射3h時(shí)刻已經(jīng)出現(xiàn)，8h時(shí)刻最高，24h時(shí)刻仍然存在。5、幼鼠肝臟組織Tollip表達(dá)情況:(1)對(duì)第二次注射0h幼鼠肝臟組織Tollip表達(dá)量進(jìn)行組間比較，各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，P0h

8、=0.98)。(2)對(duì)第二次注射3h、8h幼鼠肝臟組織Tollip表達(dá)量進(jìn)行組間比較，實(shí)驗(yàn)組幼鼠肝臟組織Tollip表達(dá)量高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組及空白對(duì)照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)對(duì)照組幼鼠肝臟組織Tonip表達(dá)量高于空白對(duì)照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(3)對(duì)第二次注射24h幼鼠肝臟組織Tollip表達(dá)量進(jìn)行組間比較，實(shí)驗(yàn)組幼鼠肝臟組織Tollip表達(dá)量略低于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);

9、實(shí)驗(yàn)組及實(shí)驗(yàn)對(duì)照組幼鼠肝臟組織Tollip表達(dá)量均明顯高于空白對(duì)照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(4)在實(shí)驗(yàn)組及實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中幼鼠肝臟組織Tollip的表達(dá)在第二次注射3h時(shí)刻已經(jīng)出現(xiàn)，8h時(shí)刻最高，24h時(shí)刻仍然存在。6、在第二次脂多糖注射后的8h、24h時(shí)刻，Myd88與HMGB-1的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r8h=0.912，P8h＜0.05; r24h=0.907，P24h＜0.05); Tollip與HMGB-1的表達(dá)水平

10、呈負(fù)相關(guān)（r8h=-0.950，P8h＜0.05;r24h=-0.829，P24h＜0.05）。7、在第二次脂多糖注射后的3h、8h、24h時(shí)刻，Myd88與Tollip的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r3h=0.960, P3h＜0.05; r8h=0.844, P8h＜0.05; r24h=0.895, P24h＜0.05)。
　　結(jié)論:1、采用經(jīng)腹腔注入0.5mg/kg脂多糖，24小時(shí)后再次注入5mg/kg脂多糖的方法建立幼鼠內(nèi)毒素耐受