干預供肝CⅡTA與MyD88基因表達抑制大鼠肝移植排斥反應的實驗研究.pdf

1、本文對干預供肝CⅡTA與MyD88基因表達抑制大鼠肝移植排斥反應進行了實驗研究。本研究分為三個部分：
　　 第一部分：納米載體HGPAEs的制備及檢測。
　　 目的：制備納米載體組氨酸接枝聚（β-氨基酯）(HGPAEs)并觀察其體內應用的安全性與有效性。
　　 方法：制備納米載體組氨酸接枝聚（β-氨基酯）(HGPAEs)，并對其進行性能測試;設置生理鹽水組、納米載體組和納米載體質粒組，經(jīng)門靜脈注射體內轉染大鼠肝臟

2、，采取轉染后第一天和第三天肝臟標本和靜脈血，應用全波長酶標儀檢測方法評價體內肝臟轉染效果，并檢測大鼠肝腎功能變化。
　　 結果：成功制備了納米載體組氨酸接枝聚（β-氨基酯）(HGPAEs)，經(jīng)驗證其具有作為基因載體的必備條件;第一天和第三天納米載體質粒組的增強型綠熒光蛋白熒光強度均顯著強于生理鹽水對照組和納米載體組(P＜0.01)，納米載體質粒組第三天熒光強度強于第一天(P＜0.01);轉染術后第一天，與正常值比較，各組ALT、

3、AST均顯著升高(P＜0.01)，但各組間比較無明顯差異(P＞0.05)，轉染術后第三天，各組生化指標均趨于正常。
　　 結論：納米載體組氨酸接枝聚（β-氨基酯）制備簡便，是一種安全高效的基因載體;以納米載體為介導經(jīng)門靜脈注射的方法可使shRNA質粒在體內肝臟獲得高效轉染。
　　 第二部分：納米載體介導沉默基因CⅡ TA和MyD88表達的體內研究。
　　 目的：觀察RNA干擾對免疫識別相關基因CⅡTA、MHC-Ⅱ

4、和MyD88表達的抑制效果。
　　 方法：設置生理鹽水對照組、納米載體組、納米載體pHK-shRNA組和納米載體pCⅡ TA-shRNA組、納米載體pMyD88-shRNA組、納米載體pCⅡTA-pMyD88-shRNA組三個干預組，通過門靜脈注射方法體內轉染大鼠肝臟，轉染后第三天取肝臟，以熒光定量PCR和western blot分別檢測肝臟轉染后CⅡ TA、MHC-Ⅱ和MyD88基因mRNA和蛋白水平的表達變化。
　　

5、 結果：熒光實時定量PCR和western blot檢測顯示納米載體pCⅡ TA-shRNA組和納米載體pCⅡTA-pMyD88-shRNA組CⅡ TA和MHCⅡ基因mRNA和蛋白表達均較生理鹽水組、納米載體組和納米載體pHK-shRNA組顯著降低(P＜0.01);納米載體pMyD88-shRNA組和納米載體pCⅡTA-pMyD88-shRNA組MyD88基因mRNA和蛋白表達較生理鹽水組、納米載體組和納米載體pHK-shRNA組也有顯

6、著降低(P＜0.01);而納米載體組、納米載體pHK-shRNA組與生理鹽水組之間CⅡ TA、MHCⅡ和MyD88基因無論mRNA還是蛋白表達均無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 結論：以納米載體(HGPAEs)為介導經(jīng)門靜脈注射的方法，應用針對CⅡ TA和MyD88的shRNA質粒轉染大鼠肝臟，可顯著抑制肝臟CⅡTA、MHC-Ⅱ和MyD88基因表達。
　　 第三部分：干預供體移植物抑制大鼠肝移植排斥反應的研究。

7、>　　 目的：觀察抑制供體肝臟CⅡ TA和MyD88基因的表達對高應答大鼠原位肝移植模型移植排斥反應的影響，探討其抗排斥機制。
　　 方法：建立高應答大鼠原位肝移植模型;設置生理鹽水組、納米載體組、pHK-shRNA納米載體組、納米載體pCⅡ TA-shRNA組、納米載體pMyD88-shRNA組和納米載體pCⅡTA-pMyD88-shRNA組，各組采用經(jīng)門靜脈注射的方法干預供體大鼠肝臟，干預后3天取肝臟進行肝移植，每組各12

8、只大鼠，于移植術后第5天隨機選取6只大鼠取靜脈血和移植肝臟，病理切片確定排斥反應分級，分別采用熒光定量PCR和western blot檢測肝臟中CⅡ TA、MHC-Ⅱ和MyD88基因在mRNA和蛋白水平的表達變化，流式細胞術檢測血中CD4/CD8細胞比例， ELISA法檢測血清IL-2和IFN-γ濃度，并檢測肝功能，其余6只用于觀察存活期。
　　 結果：穩(wěn)定建立高應答大鼠原位肝移植模型;與生理鹽水組、納米載體組和納米載體pHK-

9、shRNA組相比，納米載體pCⅡ TA-shRNA組、納米載體pMyD88-shRNA組和納米載體pCⅡ TA-pMyD88-shRNA組大鼠存活時間明顯延長（中位生存期16天、14天和21天vs10天、9天和8天，P＜0.01），排斥反應病理分級明顯降低(P＜0.01)，CⅡ TA、MHC-Ⅱ和MyD88的mRNA轉錄水平和蛋白表達量均明顯降低(P＜0.01)，血液CD4/CD8細胞比例顯著降低(P＜0.01)，血清IL-2和IFN-