OX40在內毒素耐受大鼠肝組織中的表達及意義.pdf

1、目的:急性肝功能衰竭(ALF)可在短時間內導致大量肝細胞壞死，引起肝功能嚴重障礙，其并發(fā)癥多，死率高達50％，ALF逐漸成為危害全球人類健康嚴重疾病之一。前人的研究已發(fā)現多種肝衰竭的發(fā)病機制，免疫功能破壞、組織細胞炎癥反應和機體內毒素血癥等都是重要環(huán)節(jié)，其中機體免疫功能受損起關鍵作用，免疫功能受損后肝組織炎癥以及產生的細胞因子連鎖反應可刺激多種炎癥介質大量釋放，進而進一步加重肝組織損傷。
　　 共刺激分子OX40是屬TNF-受體

2、家族成員之一，可以部分逆轉大鼠T細胞數量減少的趨勢，并促使CD4+T細胞等炎癥細胞進入外周血中，再移行到炎癥部位，刺激T細胞釋放多種炎癥因子，進一步放大機體對炎癥刺激的反應能力，進而誘導肝細胞損傷甚至凋亡。
　　 脂多糖(LPS)是內毒素主要成分，內毒素耐受(ETT)是指先給予小劑量LPS或類似的物質刺激機體或者單核-巨噬細胞系統(tǒng)后，機體或細胞對致死量的LPS表現出低反應性甚至無反應性。目前，有越來越多學者投入到ETT對肝衰竭影

3、響的研究當中，但ETT形成的具體機制尚未明確。
　　 本實驗通過觀察內毒素耐受及正常大鼠接受D-胺基半乳糖(D-GaiN)/LPS注射后肝組織OX40表達的變化，探討內毒素耐受發(fā)生的可能機制。
　　 方法:雄性SD大鼠54只，按隨機數字表法分為:正常對照組:6只;急性肝功能衰竭(ALF)組:24只;內毒素耐受(ETT)組:24只。前5日ETT組通過腹腔注射0.1mg/kg脂多糖(LPS)，ALF組注射生理鹽水，每日1次，

4、后1天同時注射LPS8μg/只+D氨基半乳糖(D-GalN)800 mg/kg，注射后6、12、24和48h取SD大鼠門靜脈血以及肝臟。按0.35 mL/kg用10％水合氯醛行腹腔注射麻醉，剖腹用注射器經下腔靜脈采血，離心留取血清，將部分肝組織固定于10％中性福爾馬林溶液中，石蠟包埋、切片，剩余肝組織用液氮凍存，放入-80℃冰箱。全自動生化儀器測血清ALT、AST水平。蘇木-伊紅(HE)染色下觀察肝組織病理學變化。 RT-PCR法檢測大

5、鼠肝組織OX40 mRNA表達。Western blot法測定肝組織OX40蛋白表達。ELlSA法按試劑盒操作測血清白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-a)水平。結果采用單因素方差分析法、LSD法、Dunnett's T3分析。
　　 結果:
　　 1.成功完成構建SD大鼠ALF模型:HE染色下肝小葉結構紊亂，肝索連續(xù)性破壞，肝細胞嗜酸性變、壞死，匯管區(qū)大量炎細胞浸潤。ETT組與ALF組對應時間點比較，可見

6、浸潤的炎細胞明顯減少，肝細胞腫脹以及嗜酸性變減輕。
　　 2.各組各對應時間點肝功能顯示，ALF組和ETT組血清ALT、AST水平在造模后6h開始升高(766.4±148.9，904.5±65.7)，于12h達高峰，分別為3152.2±341.0U/L和3232.8±372.0 U/L，明顯高于健康對照組31.0±5.6 U/L和37.2±6.0 U/L，與健康對照組相比，差異有統(tǒng)計學差異; ETT組上述指標水平升高幅度明顯低于

7、ALF組，與ALF組同一時間點比較，差異有統(tǒng)計學意義。
　　 3.ETT組大鼠血清TNF-a、IL-6水平雖高于健康對照組，但明顯低于ALF組。
　　 4.ALF組大鼠肝組織OX40mRNA表達上升，于造模后12h升高最明顯(3.118±0.391)，之后逐漸下降(24h1.977±0.282)。ETT組大鼠肝組織各時間點OX40mRNA表達水平高于正常對照組(0.990±0.119)，但較ALF組低，兩組相比，差異具備

8、統(tǒng)計學意義。
　　 5.各組大鼠肝組織Western blot結果顯示，隨著肝衰竭的進展OX40蛋白的表達量逐漸增高，于12h達峰值(0.804±0.067)，24小時開始下降(0.661±0.057)。ETT組OX40蛋白表達水平較ALF組降低，各時間點相比，差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結論:
　　 1.OX40在正常SD大鼠中有少量表達;
　　 2.ALF組大鼠肝組織OX40表達隨著肝衰竭的進展表達水平