基于SCR技術(shù)的多層rFN-CDH融合蛋白界面促成骨效應(yīng)及其機(jī)制研究.pdf

1、自體骨是植骨材料的“金標(biāo)準(zhǔn)”，然而取骨會(huì)造成嚴(yán)重的并發(fā)癥，臨床需要大量高活性骨替代材料。成骨性、骨誘導(dǎo)性和骨傳導(dǎo)性是影響骨愈合的核心因素。羥基磷灰石、β-磷酸三鈣、多聚乳酸等合成材料及脫鈣骨基質(zhì)（demineralized bone matrix，DBM）等天然生物材料缺乏成骨前體細(xì)胞和成骨誘導(dǎo)因子，成骨活性十分有限。經(jīng)典的組織工程骨(tissue engineered bone，TEB)成骨能力良好，但制備過程復(fù)雜，難以實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化。

2、骨髓中含有豐富的成骨相關(guān)細(xì)胞和因子，既往研究表明骨髓局部注射或與支架材料復(fù)合可促進(jìn)骨愈合。通過選擇性細(xì)胞滯留(selective cell retention，SCR)技術(shù)，可以有效地將骨髓中成骨成分富集于疏松多孔材料，從而實(shí)現(xiàn)高活性組織工程骨術(shù)中構(gòu)建。
　　由于制備過程中細(xì)胞外基質(zhì)大量丟失，通常用于SCR技術(shù)的DBM支架材料骨髓富集效率相對(duì)有限，通過表面修飾增強(qiáng)支架材料粘附性是提高富集效率和特異性的有效手段。在前期研究中，課題組

3、采用多聚賴氨酸、RADA-16I水凝膠等修飾DBM支架材料，修飾后材料孔徑縮小，對(duì)細(xì)胞物理攔截作用增強(qiáng)，材料骨髓富集效率和成骨能力均顯著提高。然而多聚賴氨酸、RADA-16I水凝膠缺乏粘附識(shí)別信號(hào)，富集細(xì)胞特異性差，富集后缺乏促進(jìn)成骨的生物刺激。隨著成骨誘導(dǎo)微環(huán)境研究不斷深入，模擬細(xì)胞外基質(zhì)和周圍細(xì)胞作用的支架仿生修飾成為骨組織工程領(lǐng)域近年來研究熱點(diǎn)。為避免天然蛋白成本高、免疫原性、易酶解和短肽特異性差的缺點(diǎn)，多采用高分子多肽或模擬肽。

4、課題組前期通過整合纖維連接蛋白（fibronectin）Ⅲ7-10結(jié)構(gòu)域和鈣粘蛋白(Cadherin11)胞外片段第1、2結(jié)構(gòu)域構(gòu)建的異源雙分子嵌合式融合蛋白rFN/CDH，該蛋白具有良好的促粘附、促增殖、促成骨效應(yīng)。本研究擬通過層層自組裝技術(shù)構(gòu)建多層rFN/CDH融合蛋白復(fù)合物修飾DBM支架材料，改善材料表面性質(zhì)，從而提高SCR過程中成骨相關(guān)成分的富集效率，并在植入體內(nèi)后持續(xù)發(fā)揮成骨誘導(dǎo)作用。
　　目的：通過層層自組裝技術(shù)構(gòu)建基

5、于SCR技術(shù)的多層rFN/CDH融合蛋白界面修飾DBM支架材料，增強(qiáng)成骨相關(guān)細(xì)胞和因子在SCR多孔載體的表面和內(nèi)部富集效應(yīng)，探討SCR過程中成骨相關(guān)成分富集和富集后復(fù)合物促進(jìn)成骨的潛在機(jī)制，為進(jìn)一步研究與開發(fā)術(shù)中即刻構(gòu)建新型組織工程骨修復(fù)材料提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。
　　方法：
　　1.DBM-LBL-rFN/CDH制備及體外檢測(cè):通過聚乙烯亞胺提供初始電荷，以殼聚糖為陽離子，rFN/CDH為陰離子，層層自組裝構(gòu)建多層rFN

6、/CDH融合蛋白修飾界面。通過接觸角檢測(cè)觀察支架材料表面化學(xué)成分改變確定修飾方案;通過X線光電子能譜(XPS)分析修飾前后材料表面元素組成變化;通過掃描電鏡觀察支架材料表面形態(tài)及孔徑變化;液體位移法檢測(cè)材料孔隙率變化;rFN/CDH融合蛋白免疫熒光觀察蛋白在支架材料表面分布情況，震蕩漂洗實(shí)驗(yàn)檢測(cè)支架材料穩(wěn)定性;將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow stem cells，hBMSCs)接種至支架材料表面，計(jì)算接種細(xì)胞上

7、架率，連續(xù)培養(yǎng)3天、7天后，細(xì)胞骨架染色、CCK-8法觀察細(xì)胞在支架材料表面增殖情況;接種細(xì)胞后成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，Western Blot檢測(cè)骨鈣素(osteocalcin)、骨橋蛋白(osteoponin)等成骨標(biāo)記表達(dá)情況。
　　2.DBM-LBL-rFN/CDH骨髓富集效率及其對(duì)BMSCs遷移、增殖和成骨分化的影響:SCR構(gòu)建DBM-LBL-rFN/CDH富集骨髓組織工程骨，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SCR過程中材料富集的細(xì)胞組成，蛋白質(zhì)芯

8、片和ELISA檢測(cè)富集材料中成骨相關(guān)細(xì)胞因子水平;提取富集后支架材料總蛋白制備細(xì)胞遷移條件培養(yǎng)基、細(xì)胞增殖條件培養(yǎng)基、成骨分化條件培養(yǎng)基。以細(xì)胞遷移條件培養(yǎng)基構(gòu)建hBMSCs體外遷移trans-well模型，檢測(cè)支架材料富集的細(xì)胞及因子對(duì)hBMSCs遷移的影響;以細(xì)胞增殖條件培養(yǎng)基培養(yǎng)hBMSCs，CCK-8法檢測(cè)富集材料細(xì)胞增殖的影響;以成骨誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)hBMSCs成骨分化，RT-PCR、WB檢測(cè)堿性磷酸酶(alkaline p

9、hosphatase，ALP)、OCN、OPN等成骨標(biāo)記表達(dá)情況，評(píng)價(jià)富集材料富集的細(xì)胞及因子對(duì)hBMSCs成骨分化的影響。
　　3.DBM-LBL-rFN/CDH骨髓富集材料體內(nèi)成骨效應(yīng)及其募集宿主細(xì)胞參與成骨效應(yīng)研究:用DBM-LBL-rFN/CDH骨髓富集材料修復(fù)FVB/N小鼠股骨缺損模型，術(shù)后4周，Micro-CT、HE染色及masson染色評(píng)價(jià)成骨情況，扭轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)和三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)骨缺損修復(fù)后生物力學(xué)強(qiáng)度;術(shù)后通過尾靜脈注

10、射綠色熒光蛋白標(biāo)記的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mouse BMSCs，mBMSCs)，術(shù)后3天取植骨區(qū)標(biāo)本，ELISA檢測(cè)植骨區(qū)SDF-1α濃度，免疫熒光檢測(cè)富集后組織工程骨募集BMSCs的能力。
　　結(jié)果:
　　1.材料修飾8層后隨著修飾層數(shù)增加，接觸角呈規(guī)律的波動(dòng)在34°(rFN/CDH)至45°(Chi)之間，提示材料表面組成已趨于穩(wěn)定，為確保修飾界面在SCR及植入體內(nèi)后持續(xù)發(fā)揮作用，我們將修飾12層的界面(即PEI-rF

11、N/CDH-(Chi-rFN/CDH)5)確認(rèn)為最終修飾方案，并以LBL-rFN/CDH指代;XPS檢測(cè)表面元素組成結(jié)果提示，DBM表面主要為碳元素（90.48±0.19％），當(dāng)修飾材料最外層為Chi時(shí)表面碳、氮、氧元素含量分別為51.63±0.64％、15.42±0.2％、32.31±0.35％，而最外層為rFN/CDH時(shí)，分別為45.91±0.61％、18.47±0.29％、34.40±0.19％，支架材料表面元素組成隨修飾過程明顯

12、改變;DBM支架材料表面光滑，修飾后的支架材料表面形成大量不規(guī)則凸起，材料孔隙內(nèi)部形成新的小孔，平均孔徑由463±110μm下降至246±87μm; DBM-LBL-rFN/CDH孔隙率為0.620±0.152，與DBM(0.660±0.153)無明顯差異;免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)強(qiáng)力震蕩漂洗前后DBM-LBL-rFN/CDH材料表面蛋白含量均明顯多于單純浸泡的DBM-rFN/CDH支架材料，提示材料修飾高效且穩(wěn)定;修飾后的支架材料接種hBMS

13、Cs細(xì)胞上架率71.2±5.9％，顯著高于DBM組（54.0±3.7％），具有更強(qiáng)的粘附性;接種BMSCs培養(yǎng)3天和7天后，細(xì)胞骨架染色和CCK-8檢測(cè)提示DBM-LBL-rFN/CDH支架材料表面顯著多于DBM組，表明LBL-rFN/CDH可促進(jìn)MSCs增殖;成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，DBM-LBL-rFN/CDH組細(xì)胞OCN、OPN等表達(dá)明顯強(qiáng)于DBM組，表明LBL-rFN/CDH可提供良好的促成骨微環(huán)境。
　　2.DBM-LBL-rF

14、N/CDH支架材料有核細(xì)胞富集率和富集倍數(shù)(29.35±1.69％、2.80±0.16)顯著高于DBM組（18.55±1.47％和1.69±0.13），封閉骨髓細(xì)胞表面識(shí)別RGD序列的整合素后，富集率和富集倍數(shù)下降至23.70±1.87％和2.29±0.18;DBM-LBL-rFN/CDH富集的有核細(xì)胞中，識(shí)別RGD的整合素(α3和αV)陽性細(xì)胞比例為60.51±4.11％和32.72±3.89％，明顯高于DBM組（48.13±2.89

15、％和21.89±2.26％），封閉整合素后，該比例下降至(49.97±5.04％和25.38±2.42％);成骨相關(guān)的BMSCs、造血干細(xì)胞、單核細(xì)胞變化趨勢(shì)也與此相類似。細(xì)胞因子芯片和ELISA檢測(cè)結(jié)果提示富集骨髓后DBM-LBL-rFN/CDH支架材料中CXCL3、IFN-γ、 bFGF、BMP-2、BMP-6、MDC、SDF-1α、PDGF-BB等成骨相關(guān)因子明顯多于DBM組和DBM/SAP組。DBM-LBL-rFN/CDH富集后

16、材料蛋白提取物較DBM組和DBM/SAP組具有更強(qiáng)的促進(jìn)細(xì)胞遷移、增殖和成骨分化的能力。
　　3.綠色熒光蛋白特異性免疫熒光和小動(dòng)物成像結(jié)果均證實(shí)DBM-LBL-rFN/CDH植入體內(nèi)后可募集更多的尾靜脈注射的mBMSCs，同時(shí)材料局部SDF-1α濃度明顯高于DBM組和DBM/SAP組，提示富集骨髓的DBM-LBL-rFN/CDH復(fù)合物可募集宿主細(xì)胞促進(jìn)骨修復(fù)。影像學(xué)檢查、生物力學(xué)測(cè)試、HE和Masson染色均證實(shí)修復(fù)臨界骨缺損具