負(fù)載乙酰半胱氨酸(NAC)的絲素基生物活性骨水泥椎體強(qiáng)化的應(yīng)用評(píng)價(jià)及其促成骨機(jī)制研究.pdf

1、第一部分負(fù)載NAC絲素基生物活性骨水泥的制備及理化性能表征
　　目的：將N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl cysteine，NAC）載入SF/CPC體系，制備負(fù)載NAC的絲素（SF）基磷酸三鈣（α-TCP）生物活性骨水泥（NAC/SF/α-TCP），并對(duì)其理化性能進(jìn)行表征。
　　方法：向含6％的絲素溶液中加入10mM和25mM不同濃度的NAC配制骨水泥固化液，該固化液與α-TCP粉末以液固比0.4ml：1g混合制備NAC/

2、SF/α-TCP骨水泥。采用吉爾摩雙針法測(cè)定骨水泥凝固時(shí)間；力學(xué)測(cè)試儀測(cè)試骨水泥凝固后抗壓強(qiáng)度；觀察其在 PBS中的抗?jié)⑸⑿裕籜線衍射分析其晶體成分，掃描電鏡觀察骨水泥凝固后其表面形貌。
　　結(jié)果：向含6%的絲素溶液固化液中加入25mM的NAC后，初凝時(shí)間為21.77±1.07（min），終凝時(shí)間為31.88±1.69（min），比α-TCP骨水泥的初凝時(shí)間58.67±1.185（min）和終凝時(shí)間77.38±2.45（min）明

3、顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；骨水泥的抗壓強(qiáng)度為49.39±1.68（MPa），比α-TCP骨水泥抗壓強(qiáng)度13.60±3.31（MPa）和SF/α-TCP組抗壓強(qiáng)度29.86±4.17（MPa）明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；NAC/SF/α-TCP和SF/α-TCP加入PBS后觀察12小時(shí)仍未發(fā)生明顯潰散，而α-TCP骨水泥加入PBS中，即刻發(fā)生潰散；XRD顯示NAC/SF/α-TCP骨水泥固化后主要成分是羥基

4、磷灰石（HA）；掃描電鏡顯示NAC/SF/α-TCP比α-TCP骨水泥表面可見更多取向一致的致密團(tuán)簇狀HA結(jié)晶。
　　結(jié)論：成功制備的負(fù)載25mM NAC的生物活性絲素蛋白磷酸鈣骨水泥（NAC/SF/α-TCP）可明顯提高SF/α-TCP的抗壓強(qiáng)度。
　　第二部分負(fù)載NAC絲素基生物活性骨水泥體外增強(qiáng)椎體生物力學(xué)研究
　　目的：研究負(fù)載NAC的絲素（SF）基磷酸三鈣（α-TCP）生物活性骨水泥（NAC/SF/α-TCP

5、）對(duì)骨缺損椎體的強(qiáng)化作用，并與最常用的椎體強(qiáng)化材料PMMA以及項(xiàng)目組既往研制的絲素基磷酸三鈣骨水泥進(jìn)行比較，來(lái)評(píng)價(jià)此生物活性骨水泥在椎體成形術(shù)或后凸成形術(shù)中用來(lái)強(qiáng)化椎體的應(yīng)用前景。
　　方法：取35個(gè)綿羊椎體，隨機(jī)分成5組，每組7椎。以直徑為6.0mm鉆頭垂直椎體矢狀面橫向鉆通椎體雙側(cè)皮質(zhì)，制作椎體骨缺損模型；向此椎體骨缺損模型中填充PMMA、SF/α-TCP、NAC/SF/α-TCP骨水泥，對(duì)填充骨水泥的椎體進(jìn)行生物力學(xué)測(cè)試，并

6、與正常椎體及空白骨缺損模型比較椎體強(qiáng)度和剛度。
　　結(jié)果：各組椎體骨缺損區(qū)骨水泥注入順利。生物力學(xué)測(cè)試結(jié)果顯示各骨水泥組椎體均得到了增強(qiáng)。PMMA組抗壓強(qiáng)度最高，達(dá)3455±911.5（N），其次為NAC/SF/α-TCP組和正常椎體組強(qiáng)度，空白對(duì)照組強(qiáng)度最低，為1859±479.3（N）。NAC/SF/α-TCP組與正常椎體組和PMMA組相比無(wú)顯著性差異。注入骨水泥后各組椎體剛度得到不同程度的升高。NAC/SF/α-TCP和 P

7、MMA組剛度與空白對(duì)照組相比顯著增強(qiáng)，分別為1951±265.4（N/m）（P=0.0008）和2154±347.4.1（N/m）（P＜0.001）。相對(duì)于SF/α-TCP組，NAC/SF/α-TCP組在恢復(fù)椎體剛度的能力上略高，幾乎與 PMMA相當(dāng)，但仍都低于正常椎體組。
　　結(jié)論：負(fù)載NAC的絲素基生物活性骨水泥（NAC/SF/α-TCP），經(jīng)生物力學(xué)測(cè)試顯示其體外強(qiáng)化椎體可明顯提高椎體的強(qiáng)度和剛度，可能在VP或KP中具有一定

8、的應(yīng)用前景。
　　第三部分負(fù)載NAC絲素基生物活性骨水泥修復(fù)骨缺損的體內(nèi)研究
　　目的：探討負(fù)載NAC的絲素基磷酸三鈣生物活性骨水泥（NAC/SF/α-TCP）修復(fù)骨缺損的效果，分析骨水泥在體內(nèi)與松質(zhì)骨的結(jié)合、材料周圍新骨生成和材料剩余情況。
　　方法：40只SD大鼠，在雙側(cè)股骨髁距股骨下端關(guān)節(jié)面3.0mm處垂直股骨矢狀面制作直徑3.5mm深0.5mm骨缺損，分別填入調(diào)制好的NAC/SF/α-TCP和SF/α-TCP兩

9、種骨水泥或留作空白對(duì)照。4周和8周的股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)觀察各樣本骨缺損區(qū)抗彎曲強(qiáng)度，Micro-CT和HE染色觀察骨水泥填充骨缺損4周和8周后周圍的新骨生成和骨水泥降解情況。Lane-Sandhu影像學(xué)和組織學(xué)評(píng)分評(píng)價(jià)兩種骨水泥植入4周和8周后骨水泥與松質(zhì)骨結(jié)合情況。
　　結(jié)果：骨缺損區(qū)骨水泥注入順利，三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)結(jié)果顯示空白對(duì)照組、SF/α-TCP和NAC/SF/α-TCP組的抗彎曲強(qiáng)度隨著時(shí)間推移呈逐漸增高趨勢(shì)，但總低于正常對(duì)照

10、組。Micro-CT掃描和HE染色顯示骨水泥植入體內(nèi)4周后周圍開始有新生骨形成，骨水泥部分降解；8周時(shí)NAC/SF/α-TCP組周圍新生骨明顯較SF/α-TCP組增多（P＜0.05），骨小梁向骨水泥中滲入，NAC/SF/α-TCP殘留也少于SF/α-TCP（P＜0.05）。4周和8周NAC/SF/α-TCP組Lane-Sandhu影像學(xué)和組織學(xué)評(píng)分均明顯高于SF/α-TCP（P＜0.05）
　　結(jié)論：負(fù)載NAC的絲素基生物活性骨水

11、泥（NAC/SF/α-TCP），經(jīng)體內(nèi)修復(fù)大鼠股骨遠(yuǎn)端骨缺損的體內(nèi)觀察研究表明，相對(duì)于 SF/α-TCP，其具有較好的成骨能力，能促進(jìn)骨水泥材料周圍新生骨的生成。
　　第四部分負(fù)載NAC絲素基生物活性骨水泥促成骨機(jī)制研究
　　目的：探討負(fù)載 NAC生物活性骨水泥（NAC/SF/α-TCP）促進(jìn)成骨分化作用，及其促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的相關(guān)信號(hào)通路，揭示NAC/SF/α-TCP促成骨作用的相關(guān)機(jī)制。
　　方法：取NAC/SF/

12、α-TCP和SF/α-TCP材料的浸提液，與成骨細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞株，在成骨誘導(dǎo)條件下分別培養(yǎng)一定的時(shí)間后，行 ALP活性檢測(cè)和茜素紅染色觀察成骨細(xì)胞分化情況，實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western Blot法檢測(cè)Runx2、Osterix、β-catenin和OCN等成骨相關(guān)基因的表達(dá)。在成骨細(xì)胞培養(yǎng)基中加入DKK1后觀察成骨細(xì)胞分化和上述各蛋白的表達(dá)量變化情況。
　　結(jié)果：NAC組（NAC/SF/α-TCP浸提液）與細(xì)胞

13、培養(yǎng)3天后ALP活性較對(duì)照組（Control組）明顯升高（P＜0.05）；21天后茜素紅染色可見NAC組較Control組和SF/α-TCP組明顯紅染。Western Blot和不同時(shí)間點(diǎn)的RT-PCR結(jié)果顯示NAC組成骨細(xì)胞Runx2、Osterix、β-catenin和OCN較對(duì)照組和SF/α-TCP組表達(dá)增高；在3天和7天時(shí)RT-PCR顯示NAC組與對(duì)照組和SF/α-TCP組之間的Runx2、Osterix、β-catenin和O