護(hù)骨膠囊多成分定性、定量分析及其體外促成骨機(jī)制初步研究.pdf

1、[目的]
　　 1.采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)，對(duì)護(hù)骨膠囊的多種成分進(jìn)行定性和定量分析，為護(hù)骨膠囊的藥效研究提供質(zhì)量控制的基礎(chǔ)。
　　 2.觀察護(hù)骨膠囊對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠成骨細(xì)胞增殖、分化的影響，探討其體外促成骨分化的作用機(jī)制。
　　 [方法]
　　 1.采用RP-HPLC，KromasilC18色譜柱(5.0μm,250mm×4.6mm)，流動(dòng)相為乙腈-1％冰醋酸，梯度洗脫，流速:0.8ml

2、/min，柱溫:30℃，檢測(cè)波長(zhǎng):320nm，通過(guò)護(hù)骨膠囊全方圖譜分別與組方藥物所含綠原酸、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、淫羊藿苷等對(duì)照品圖譜、組方藥物圖譜進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)護(hù)骨膠囊圖譜中各成分的歸屬。
　　 2.采用RP-HPLC，KromasilC18色譜柱(5.0μm,250mm×4.6mm)，流動(dòng)相為甲醇—乙腈—1％冰醋酸，梯度洗脫，流速:0.8 ml/min，柱溫:30℃，檢測(cè)波長(zhǎng):3

3、20nm，建立護(hù)骨膠囊中的主要成分綠原酸、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、淫羊藿苷的定量測(cè)定方法。
　　 3.采用MTT法、堿性磷酸酶法分別地檢測(cè)護(hù)骨膠囊對(duì)成骨細(xì)胞增殖和分化的作用;采用SYBR greenⅠ嵌合的RT-PCR方法檢測(cè)BMP-2和Runx2 mRNA表達(dá)水平。
　　 [結(jié)果]
　　 1.建立的HPLC-DAD方法可在一個(gè)色譜條件下，得到護(hù)骨膠囊全方及10個(gè)組方藥

4、物的多成分定性測(cè)定圖譜，明確了全方指紋圖譜中13個(gè)特征峰的歸屬;以4種對(duì)照品為對(duì)照，可確定全方中4個(gè)色譜峰所代表的化合物（綠原酸、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、淫羊藿苷）。
　　 2.對(duì)全方多成分測(cè)定方法進(jìn)行驗(yàn)證，可定量測(cè)定4種化合物，色譜峰分離情況良好，綠原酸、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、淫羊藿苷四個(gè)成分可達(dá)到定性、定量的要求。綠原酸在0.018μg

5、～0.121μg(r=0.9996)、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在0.103μg～0.689μg(r=0.9999)、阿魏酸在0.031μg～0.208μg(r=0.9992)、淫羊藿苷在0.107μg～0.710μg(r=0.9996)范圍內(nèi)，線性良好。它們的精密度RSD分別為0.99％，0.11％，0.38％，0.60％，穩(wěn)定性RSD分別為1.03％，0.11％，0.75％，0.41％，重復(fù)性RSD分

6、別為2.05％，2.38％，2.59％，1.40％，平均回收率分別為97.9％(RSD=1.72％)，97.4％(RSD=1.20％),99.4％(RSD=1.14％),98.6％(RSD=1.33％)。
　　 3.護(hù)骨膠囊在濃度0.025μg/ml～2.5μg/ml內(nèi)對(duì)成骨細(xì)胞有促增殖作用，護(hù)骨膠囊在濃度0.025μg/ml～25μg/ml內(nèi)對(duì)堿性磷酸酶的活性均有提高，護(hù)骨膠囊在濃度25μ g/ml對(duì)BMP-2和Runx2 m

7、RNA水平均有上調(diào)的作用。
　　 [結(jié)論]
　　 1.所建立HPLC測(cè)定方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好，可實(shí)現(xiàn)一個(gè)HPLC色譜條件下對(duì)護(hù)骨膠囊全方多個(gè)主成分的定性考察，提高了該復(fù)方制劑質(zhì)量控制的水平。
　　 2.所建立HPLC測(cè)定方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好，可實(shí)現(xiàn)一個(gè)HPLC色譜條件下對(duì)護(hù)骨膠囊全方中多個(gè)主成分的定量考察，可用于護(hù)骨膠囊多成分定量檢測(cè)，提高了該復(fù)方制劑質(zhì)量控制的水平。
　　 3.護(hù)骨膠囊對(duì)成骨細(xì)胞