選擇性細胞滯留技術(shù)快速構(gòu)建組織工程骨在山羊脊柱融合成骨效應(yīng)的研究.pdf

1、背景:因現(xiàn)代戰(zhàn)爭及和平時期交通、建筑等行業(yè)的高能量損傷、骨腫瘤切除、骨結(jié)核與感染等所致的骨缺損日益常見。作為治療骨缺損金標準的自體骨移植,由于存在取骨量有限和取骨區(qū)并發(fā)癥,已不能滿足骨缺損治療的需要。利用骨髓干細胞與生物材料結(jié)合構(gòu)建的組織工程骨修復骨缺損的動物實驗已獲得較為肯定的效果,但其缺點在于MSCs來源少、體外培養(yǎng)擴增周期長、技術(shù)條件高,從而影響了其在骨缺損治療中的應(yīng)用。自體紅骨髓經(jīng)皮注射在臨床治療骨不連和填充骨缺損等方面已取得一

2、定的成功,但應(yīng)用直接注入的方法,局部干細胞容易流失,影響了療效。SCR是近年來歐美學者報道的骨髓干細胞富集技術(shù)之一,主要是通過基質(zhì)材料適當?shù)木W(wǎng)孔結(jié)構(gòu)和良好的表面黏附性能,使骨髓流經(jīng)時選擇性滯留利于成骨的干細胞及促成骨因子等成分,所構(gòu)建的TEB即刻回植修復骨缺損,可獲得較理想的成骨效果。但由于受到知識產(chǎn)權(quán)保護和入關(guān)限制的影響,該技術(shù)及相關(guān)產(chǎn)品至今難以在我國臨床應(yīng)用。為了SCR技術(shù)能在我國推廣應(yīng)用,本課題組在前期實驗已經(jīng)對經(jīng)PLL修飾的人D

3、BM作為富集基質(zhì)材料的性能進行了檢測,同時觀察其在裸鼠皮下的成骨效果,并發(fā)現(xiàn)其在裸鼠皮下的成骨效果與體外常規(guī)構(gòu)建的組織工程骨相當。
　　 目的:
　　 (1)在前期工作的基礎(chǔ)之上,驗證經(jīng)PLL修飾的DBM富集基質(zhì)材料通過SCR技術(shù)構(gòu)建的TEB在山羊橫突間融合模型的成骨效果。
　　 (2)初步探討SCR技術(shù)快速構(gòu)建TEB的成骨機制。
　　 (3)SCR技術(shù)骨髓富集裝置的制備及其優(yōu)化參數(shù)的測定。
　　

4、 方法:
　　 (1)青山羊PLL-DBM材料的制備。采用多聚左旋賴氨酸修飾青山羊脫鈣骨基質(zhì)制備一種骨髓干細胞富集基質(zhì)材料,用X射線能譜分析材料鈣磷的含量、掃描電鏡觀察其顯微結(jié)構(gòu)、氨基酸成分分析檢測PLL與DBM的復合情況、并對其生物力學性能進行檢測。
　　 (2)成骨能力觀察。應(yīng)用SCR技術(shù)術(shù)中富集骨髓細胞快速構(gòu)建TEB,在青山羊橫突間融合模型上觀察其成骨能力。將24只山羊隨機分成兩組(Ⅰ組和Ⅱ組),每組12只。骨移植

5、材料分為如下四組:ⅠA組:PLL-DBM富集骨髓后構(gòu)建的TEB;ⅠB組:等量自體髂骨;ⅡC組:DBM骨髓浸泡;ⅡD組:空白DBM。將ⅠA組和ⅠB組移植材料分別植入第1組山羊個體的腰3/4左右橫突間隙;ⅡC組和ⅡD組移植材料分別植入第Ⅱ組山羊個體的腰3/4左右橫突間隙。分別于術(shù)后第8、16周分批處死山羊,取融合段標本行X線片及X線評分、三維CT及CT值檢測、組織學觀察及評分、生物力學性能檢測,評價其成骨能力。
　　 (3)成骨機制

6、的探討。①應(yīng)用SCR技術(shù)使骨髓流經(jīng)PLL-DBM材料構(gòu)建TEB,通過纖維母細胞集落形成單位計數(shù)計算PLL-DBM材料對骨髓干細胞的富集效果,ELISA法檢測富集前后骨髓上清中PDGF、IGF-Ⅰ因子表達。②采用SCR技術(shù)使PLL-DBM富集骨髓后快速構(gòu)建TEB,然后將構(gòu)建的TEB持續(xù)冷凍干燥36h去掉細胞成分,分別將SCR技術(shù)構(gòu)建的TEB(SCR組)、冷凍干燥去細胞的TEB(FTEB組)、單純DBM(DBM組)植入裸鼠皮下,分別于4、8

7、天取材,HE染色觀察組織塊上所募集的細胞情況,于第4、8、12周應(yīng)用X線攝片觀察植骨處影像密度、術(shù)后12周進行CT掃描并計算植骨區(qū)CT值、HE染色觀察植骨區(qū)組織學改變和成骨效果。
　　 (4)骨髓富集裝置的制備及其優(yōu)化參數(shù)的測定。根據(jù)SCR技術(shù)原理,自行設(shè)計研制骨髓富集裝置;應(yīng)用SCR技術(shù)使骨髓流經(jīng)富集基質(zhì)材料,通過檢測富集前后PLL-DBM對骨髓有核細胞的富集效果,確定最佳循環(huán)次數(shù)以及骨髓的流速。
　　 結(jié)果:

8、　　 (1)X射線能譜分析顯示單純DBM及PLL-DBM材料均沒有明顯的鈣磷特征波峰;氨基酸成分分析顯示PLL-DBM及單純DBM中膠原類氨基酸(GlY、Arg、Lys)含量均高,而無明顯色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和半光氨酸(Cys)等強抗原性氨基酸波峰,二者相比無明顯差異,但PLL-DBM較單純DBM有明顯的賴氨酸(Lys)波峰;PLL在材料內(nèi)外表面形成均勻的乳白色涂層,PLL-DBM孔隙率為(70±6)％,孔徑為472.5

9、1±7.02μm,孔與孔之間有約100μm左右小孔貫通,孔隙內(nèi)部有大量孔隙相互連通,并形成蜘蛛網(wǎng)樣的網(wǎng)孔結(jié)構(gòu);生物力學性能檢測顯示當材料發(fā)生60％壓縮形變時,PLL-DBM材料在最大載荷、抗壓強度明顯較DBM低(n=10,P=0.022,P=0.012),而在彈性模量二者沒有明顯差異(n=10,P=0.225)。
　　 (2)X線顯示:術(shù)后第8周時ⅠA組融合范圍不如ⅠB組寬,只是在內(nèi)側(cè)靠近椎體處有較多的成骨,但明顯較ⅡC組成骨明

10、顯,ⅡD組無明顯成骨;第16周ⅠA組、ⅠB組的融合范圍基本相當,均完全愈合,骨密度與橫突的骨密度基本一致;ⅡC的融合范圍明顯較ⅠA組、ⅠB組窄,只是在內(nèi)側(cè)靠近椎體的位置有部分融合:ⅡD組基本無融合,只是在橫突間存在島狀的成骨片。X評分第8周ⅠA組為7.17±1.17(n=6),明顯低于ⅠB組的9.00±1.10(n=6,P＜0.05),但明顯高于ⅡC的5.00±0.89(n=6)和ⅡD組的2.00±1.10(n=6);到術(shù)后第16周時,

11、ⅠA組與ⅠB組的評分分別是10.00±1.79、11.00±1.67,二者無明顯差異(n=6,P＞0.05),但明顯高于ⅡC、ⅡD組。第16周三維CT顯示:ⅠA、ⅠB組的CT值分別是696.76±102.75、766.03±69.24,二者無明顯差異(n=6,P＞0.05),均明顯高于較ⅡC組的488.63±76.40(n=6,P＜0.01),ⅡC組CT。值高于D組的91.83±31.87(n=6,P＜0.01)。組織學評分顯示與X線評

12、分類似的結(jié)果。術(shù)后第16周取移植材料融合段行生物力學性能檢測,結(jié)果顯示:ⅠA、ⅠB組在最大載荷、抗彎強度比較均無明顯差異(n=6,P＞0.05),ⅠA組較C組高(n=6,P＜0.01,P＜0.05),ⅠB組較ⅡC組高(n=6,P＜0.01,P＜0.01),ⅡC組明顯較ⅡD組高(n=6,P＜0.01)。
　　 (3)纖維母細胞集落形成單位(CFU-F)計數(shù)顯示PLL-DBM材料對骨髓干細胞的濃度富集倍數(shù)為5.68±0.49倍,而未

13、經(jīng)PLL修飾的DBM的富集倍數(shù)僅為2.23±0.27倍,二者有顯著異(n=4,P＜0.01)。PLL-DBM材料對PDGF、IGF-I兩種因子的濃度富集倍數(shù)分別是13.624±1.251,36.311±5.562(n=4)。
　　 (4)裸鼠皮下成骨實驗觀察到,術(shù)后第4天組織塊HE染色,SCR組及FTEB組置入材料上均可見較多的由植入?yún)^(qū)周圍募集到組織塊上的有核細胞,第8天組織塊上募集的細胞更多。術(shù)后第4周三組均沒有明顯的骨顯影,

14、第8周SCR組以及FTEB組已經(jīng)有較明顯的骨顯影,空白DBM組部分吸收,第12周X線片顯示SCR組和FTEB組植入物呈現(xiàn)高密度的鈣化影像,DBM組未見高密度影像出現(xiàn),植入材料基本吸收,CT結(jié)果顯示SCR組成骨區(qū)CT值為(687.67±18.55)HU(n=6),FTEB組成骨區(qū)CT值為(674.33±12.21)HU(n=6),DBM組成骨區(qū)CT值為(57.88±5.47)HU(n=6)、組織學觀察均顯示FTEB組具有與SCR組相當?shù)某?/p>

15、骨能力,空白DBM組材料已經(jīng)基本吸收,沒有類骨組織形成。
　　 (5)自制富集器最優(yōu)化的組合功能參數(shù)為:循環(huán)次數(shù)4次/骨髓流速為(100ml/3分鐘),更多的循環(huán)次數(shù)與更慢的骨髓流速組合參數(shù)并不表現(xiàn)出更佳的富集效果。
　　 結(jié)論:
　　 (1)制備的同種異體青山羊PLL-DBM材料具有天然的三維空間結(jié)構(gòu)和促進細胞黏附的PLL,生物力學彈性模量好,是一種較理想的骨髓干細胞富集基質(zhì)材料。
　　 (2)SCR技

16、術(shù)快速制備的TEB具有高成骨活性,在山羊脊柱橫突間融合模型中成骨能力與自體骨相當。
　　 (3)應(yīng)用SCR技術(shù)能使基質(zhì)材料PLL-DBM中富集較高濃度的骨髓干細胞,同時能富集較高濃度的骨生長因子。
　　 (4)基質(zhì)材料中所富集的骨髓干細胞和骨生長因子通過其自身的作用以及募集受體植骨區(qū)周圍的細胞和生長因子共同參與成骨。
　　 (5)SCR技術(shù)快速構(gòu)建的TEB經(jīng)去細胞處理后仍然具有較高的成骨活性,說明富集基質(zhì)材料上所