組織工程骨修復(fù)山羊大節(jié)段負(fù)重骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、大節(jié)段負(fù)重骨缺損是臨床上一個(gè)常見而又棘手的難題,不僅骨缺損量大,而且常常因?yàn)楣悄?、骨髓及周圍組織的毀損而缺少成骨的細(xì)胞源,易形成骨不連,遺留嚴(yán)重功能障礙.尤為重要的是,負(fù)重骨缺損不同于腔隙性骨缺損,不僅要求外形結(jié)構(gòu)的恢復(fù),更要求功能的重建——即能夠滿足負(fù)重運(yùn)動(dòng)所要求的生物力學(xué)性能.目前臨床上仍以自體骨移植作為骨缺損修復(fù)的金標(biāo)準(zhǔn),但取自體骨必然會(huì)造成供骨區(qū)的病殘,取骨量有限.為了避免自體骨移植的種種缺陷,人們對(duì)骨替代材料進(jìn)行了不懈的探索,

2、開發(fā)出人工陶瓷、生物多聚物等材料,但由于缺乏生物活性,對(duì)大節(jié)段骨缺損的修復(fù)效果還不太理想.骨組織工程學(xué)使有成骨能力的種子細(xì)胞和具有骨傳導(dǎo)能力的支架材料相結(jié)合,明顯促進(jìn)骨的再生和重塑,為大段負(fù)重骨缺損的修復(fù)提供了新的思路和方法.目前,骨組織工程研究集中在種子細(xì)胞、支架材料和二者的相互作用等方面,并在骨缺損的修復(fù)方面取得了顯著進(jìn)展.然而這一技術(shù)用于修復(fù)大節(jié)段負(fù)重骨缺損尚缺乏足夠的實(shí)驗(yàn)依據(jù),在種子細(xì)胞的獲取以及體外構(gòu)建組織工程骨技術(shù)方面仍有爭

3、議,更需要開發(fā)、篩選出既能滿足組織工程骨需要又經(jīng)濟(jì)實(shí)用的支架材料.為此,我們設(shè)計(jì)更加具有臨床參考意義的大動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)Ｐ?研究自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)復(fù)合同種異體脫鈣骨基質(zhì)(deminerilized bone matrix, DBM)構(gòu)建組織工程骨修復(fù)大節(jié)段負(fù)重骨缺損的可行性,為組織工程骨用于臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).首先,通過骨髓穿刺獲取MSCs,并在體外擴(kuò)增、向成骨細(xì)胞誘導(dǎo),獲取足量有成

4、骨潛能的種子細(xì)胞.結(jié)果顯示:1、接種后4到6天,體外培養(yǎng)的MSCs就可觀察到特異的成纖維樣集落形成單位,這是干細(xì)胞的特點(diǎn)之一.2、以3×10<'5>/cm<'2> 細(xì)胞密度接種的原代細(xì)胞9至12天長滿單層,以1×10<'4>cells/cm2接種的傳代細(xì)胞4至7天長滿單層;3、MSCs表達(dá)CD105而不表達(dá)CD45. 4、MSCs成骨誘導(dǎo)10-12天后形成鈣化結(jié)節(jié),表達(dá)堿性磷酸酶、I型膠原和骨鈣素,與成骨細(xì)胞的特征相符;5、流式細(xì)胞儀檢

5、查未發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)細(xì)胞中有異常倍數(shù)染色體.其次,制備山羊DBM,并研究其與MSCs的相互作用.結(jié)果顯示:1、DBM成立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),具有高孔隙率和孔隙連通率;2、MSCs能在DBM的表面和更深的孔壁上粘附伸展和增植;3、對(duì)一般的接種方法,當(dāng)接種細(xì)胞密度超過2×10<'6>/ml時(shí),上架細(xì)胞數(shù)即不再增加,細(xì)胞在支架上的粘附率低于75﹪; 3、雙向接種法可使細(xì)胞上架率達(dá)到80~95﹪,支架上的粘附細(xì)胞數(shù)隨接種細(xì)胞的密度增高而增加.再次,細(xì)胞支架復(fù)合

6、體和DBM被分別植入羊背部肌袋內(nèi),研究其異位成骨能力.前者組織學(xué)檢查觀察到異位成骨,且以軟骨內(nèi)成骨為主、無明顯炎癥反應(yīng),而單純支架材料無異位成骨;二者X線片上均未見明顯的成骨影像.最后,使用山羊構(gòu)建負(fù)重骨大節(jié)段缺損的動(dòng)物模型,研究組織工程骨修復(fù)骨缺損的成骨和重塑過程.結(jié)果顯示:1、術(shù)后4周實(shí)驗(yàn)組的缺損區(qū)可觀察到軟骨內(nèi)成骨,12周骨缺損被新骨連接,24周新生骨組織重塑良好、已接近正常骨干;2、植入體內(nèi)2周后,支架材料內(nèi)即可觀察到血管形成,

7、12周形成豐富的血管網(wǎng);3、植入4周后DBM開始吸收,12周后幾乎完全吸收;5、隨修復(fù)時(shí)間延長,修復(fù)組織的力學(xué)性能逐漸增強(qiáng),24周達(dá)到正常的85﹪.綜上所述,我們可以得出結(jié)論:1、MSCs的增殖能力強(qiáng),并可定向誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞分化,適合作為骨組織工程的種子細(xì)胞;2、DBM 具有良好的細(xì)胞和組織相容性,其生物降解性與體內(nèi)的成骨過程相匹配,是組織工程骨較理想的支架材料;3、雙向接種法能夠顯著提高種子細(xì)胞的上架率,有利于組織工程骨的體外構(gòu)建;4