組織工程技術(shù)修復(fù)骨缺損的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、 為了組織工程學(xué)技術(shù)更有效的在臨床應(yīng)用，本課題在既往研究基礎(chǔ)上，對骨組織工程中的部分關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行深入研究，如對建立具有臨床應(yīng)用價(jià)值的種子細(xì)胞培養(yǎng)獲取體系；建立用于組織構(gòu)建和細(xì)胞植入時(shí)，對細(xì)胞實(shí)時(shí)示蹤的不同熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)；探討新的組織構(gòu)建技術(shù)和組織工程骨移植后對骨缺損修復(fù)的影響。另外，初步探討異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞皮下移植后的分布與組織學(xué)檢測，構(gòu)建對血管生成具有核心調(diào)控作用的缺氧誘導(dǎo)因子-1α基因表達(dá)載體，從而為進(jìn)一步研究創(chuàng)造條件。

2、 研究內(nèi)容：1.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞適宜條件下的體外快速擴(kuò)增培養(yǎng)和成骨誘導(dǎo) 2.熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)對間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與分化的影響 3.纖維蛋白凝膠接種技術(shù)體外構(gòu)建組織工程骨的應(yīng)用研究 4.兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞同種異體皮下移植存活與定位的研究 5.人缺氧誘導(dǎo)因子-1α基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建及鑒定 6.組織工程骨移植修復(fù)兔尺骨骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究 主要結(jié)果和結(jié)論：1.采用自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

3、為組織工程骨的種子細(xì)胞具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。間充質(zhì)干細(xì)胞可從骨髓穿刺后梯度離心獲得，體外培養(yǎng)具有增殖較強(qiáng)，經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后可表達(dá)堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原和骨鈣素，并具有形成鈣結(jié)節(jié)的能力。在適宜培養(yǎng)條件下，4ml成人骨髓含3.2×107～6.0×107個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)3周收獲間充質(zhì)干細(xì)胞2.5×107～4.3×107，可從數(shù)量上滿足體外構(gòu)建組織工程骨種子細(xì)胞要求。 2.細(xì)胞種植密度、首次換液時(shí)間等因素對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代和傳代培

4、養(yǎng)有重要影響。間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)適宜的種植細(xì)胞密度為1×105～3×105/cm2，首次換液時(shí)間為48h。傳代培養(yǎng)時(shí)適宜的接種密度為8×103/cm2，當(dāng)接種密度過低時(shí)，可以出現(xiàn)細(xì)胞克隆，但因許多細(xì)胞不適應(yīng)低密度生長而喪失貼壁性，隨換液被清除，所以細(xì)胞總數(shù)未出現(xiàn)大幅度上升。 3.將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)的方法包括：用地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C等化學(xué)藥物或重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2、牛骨形態(tài)發(fā)生蛋白復(fù)合提取物。其中用化

5、學(xué)藥物誘導(dǎo)既可促進(jìn)Ⅰ型膠原、骨鈣素的分泌，亦可促進(jìn)細(xì)胞團(tuán)的鈣化，同時(shí)具有經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定、可控性好的特點(diǎn)。成年人間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)化學(xué)藥物成骨誘導(dǎo)后，增殖速度減慢，細(xì)胞倍增時(shí)間由36～40h變?yōu)?1～50h。 4.熒光蛋白標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行示蹤的技術(shù)具有易于檢測、表達(dá)穩(wěn)定、特異性強(qiáng)、可以實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞觀察等優(yōu)勢，可應(yīng)用于工程化組織的體外構(gòu)建和細(xì)胞植入。間充質(zhì)干細(xì)胞在標(biāo)記增強(qiáng)型綠色熒光蛋白或紅色熒光蛋白后，仍然具有較強(qiáng)的體外增殖能力，并維持成

6、骨和成脂肪能力。選用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體比普通真核表達(dá)載體，具有更高的表達(dá)效率和維持時(shí)間。因此在對活細(xì)胞示蹤時(shí)，宜選用逆轉(zhuǎn)錄病毒方式標(biāo)記增強(qiáng)型綠色熒光蛋白。 5.通過熒光蛋白示蹤技術(shù)，發(fā)現(xiàn)將種子細(xì)胞直接滴加在支架材料內(nèi)的沉淀法構(gòu)建細(xì)胞-材料復(fù)合體時(shí)，容易出現(xiàn)細(xì)胞接種數(shù)量少、且分布不均勻等缺陷；而采用纖維蛋白凝膠接種技術(shù)構(gòu)建細(xì)胞-材料復(fù)合體時(shí)，通過細(xì)胞示蹤、計(jì)數(shù)和掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)接種細(xì)胞的效率大為提高，細(xì)胞在材料內(nèi)的分布更均勻，從而有

7、利于提高復(fù)合體的生物學(xué)活性。 6.將細(xì)胞標(biāo)記熒光蛋白或BrdU進(jìn)行細(xì)胞示蹤的技術(shù)可以在一定范圍內(nèi)用于研究細(xì)胞在體內(nèi)的遷移和增殖分化等生物學(xué)特性。在聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)或BrdU示蹤技術(shù)對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記后，通過兔同種異體皮下植入與細(xì)胞自體皮下植入進(jìn)行對比分析，發(fā)現(xiàn)異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以在具有免疫功能的皮下組織中至少存活5周，細(xì)胞在局部具有較強(qiáng)的遷移能力，提示可能參與了宿主的某些功能作用，這為進(jìn)一步深入研究間充質(zhì)

8、干細(xì)胞異體移植應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。 7.構(gòu)建了含人缺氧誘導(dǎo)因子-1α基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，并且經(jīng)多種酶切鑒定分析和PCR鑒定，結(jié)果證實(shí)重組缺氧誘導(dǎo)因子-1α逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建成功。該載體除了具有pLEGFP-N1逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的應(yīng)用特點(diǎn)外，由于使人缺氧誘導(dǎo)因子-1α基因和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因位于同一條mRNA上，其間含核糖體插入位點(diǎn)序列，人缺氧誘導(dǎo)因子-1α和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白為各自獨(dú)立的蛋白，因而可通過觀測細(xì)胞產(chǎn)生熒光來提示上