基因增強的組織工程骨修復(fù)眼眶骨缺損的研究.pdf

1、眼眶骨折所致的眼眶骨缺損是眼科常見疾病，會導(dǎo)致不同程度的面中部畸形、眼球位置及視功能異常等。目前常用的眼眶骨缺損的修復(fù)方法是將生物材料連接在骨缺損的兩端，起到支撐眶內(nèi)容物的作用，但多存在感染、排異、移位等并發(fā)癥。本研究聯(lián)合應(yīng)用體外基因治療技術(shù)和組織工程技術(shù)，觀察基因增強的組織工程骨對眶骨缺損的修復(fù)效果。 目的： 將VEGF基因和BMP2基因通過復(fù)制缺陷型腺病毒載體導(dǎo)入骨髓基質(zhì)干細胞(BMSCs)，使之能夠穩(wěn)定表達目的蛋白

2、，并作為種子細胞構(gòu)建基因修飾的組織工程化骨，回植動物體內(nèi)修復(fù)眶骨缺損。通過增強組織工程化骨的早期血管化和成骨能力，增加體內(nèi)新骨形成量，加快骨缺損修復(fù)和骨愈合的進程。 方法： 1.抽取實驗動物的骨髓，分離培養(yǎng)BMSCs，用攜帶人VEGF和BMP2基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs，以未轉(zhuǎn)染組BMSCs為對照，進行細胞生物學(xué)及成骨活性檢測，包括：①RT-PCR及熒光定量PCR檢測目的基因表達情況；②免疫細胞化學(xué)及Western-

3、blot檢測目的蛋白分泌情況；③流式細胞儀檢測細胞周期的改變；④MTT法生長曲線檢測細胞增殖能力；⑤成骨分化能力的檢測。 2.將分別轉(zhuǎn)染VEGF基因和轉(zhuǎn)染BMP2基因的BMSCs按照10:1，4:1，1:1，1:4，1:10的比例進行混合，以等相同數(shù)量的細胞與等體積的珊瑚支架材料體外復(fù)合培養(yǎng)，觀察細胞在支架上的生長增殖情況及ELISA檢測目的蛋白的持續(xù)分泌情況。將細胞材料復(fù)合體植入裸鼠皮下，分別于植入后2w、4w、8w取材進行組

4、織學(xué)檢測，比較其異位成骨能力，篩選出代表最適成骨能力的基因組合比例。 3.制備兔眶下緣12mm長的節(jié)段性骨缺損模型，分別以自體未轉(zhuǎn)染基因的BMSCs和轉(zhuǎn)染基因的BMSCs構(gòu)建組織工程骨，自體回植修復(fù)骨缺損，以單純材料組和曠置組作為對照。術(shù)后4w、8w、16w取材，行大體觀察、骨密度檢測、Micro-CT檢查、組織學(xué)和組織形態(tài)學(xué)的觀察，對結(jié)果進行統(tǒng)計分析，評價基因增強的組織工程骨修復(fù)眶下緣骨缺損效果。 4.在比格犬的眼眶內(nèi)

5、側(cè)壁對應(yīng)篩竇的位置，制備直徑12mm的圓形眶壁骨缺損模型，分別以自體未轉(zhuǎn)染基因的BMSCs和轉(zhuǎn)染基因的BMSCs構(gòu)建組織工程骨，自體回植修復(fù)骨缺損，以單純材料組和曠置組作為對照。術(shù)后4w、12w、24w分別取材，進行大體觀察、骨密度檢測、Micro-CT檢查、組織學(xué)及組織學(xué)形態(tài)學(xué)觀察，對結(jié)果進行統(tǒng)計分析，評價基因增強的組織工程骨修復(fù)眼眶壁骨缺損的修復(fù)效果。 結(jié)果： 1.MOI=150時轉(zhuǎn)染BMSCs，轉(zhuǎn)染效率能達到95％

6、以上。細胞轉(zhuǎn)染基因后其生長周期、增殖能力不受影響，轉(zhuǎn)染后的BMSCs能夠高表達目的基因和蛋白，其中轉(zhuǎn)染BMP2的細胞成骨分化能力明顯增強。 2.轉(zhuǎn)基因的BMSCs按照不同比例混合，復(fù)合珊瑚材料植入裸鼠體內(nèi)后的成骨效果明顯不同。2w時材料內(nèi)部大部分為纖維組織所填充。4w時開始出現(xiàn)肥大軟骨細胞，并有少量的類骨質(zhì)形成。8w時以VEGF:BMP2為1:4組的新生骨量明顯高于其他各組(p<0.05)。轉(zhuǎn)染VEGF組形成的新生血管數(shù)量明顯多

7、于其他各組，但成骨量卻少于轉(zhuǎn)染BMP2組(p<0.05)。 3.12mm長的兔眶下緣骨缺損在本研究觀察期內(nèi)無1例自行愈合。以轉(zhuǎn)基因的自體BMSCs構(gòu)建的組織工程骨修復(fù)效果各有不同：4w時BMP2+VEGF組新骨生成速度(4.92±0.36μm/day)明顯高于BMP2組(3.25±0.17μm/day)；VEGF組(2.67±0.79μm/day)和未轉(zhuǎn)染基因組(2.33±0.3μm/day)(p<0.05)；16w時BMP2+

8、VEGF組已完全修復(fù)骨缺損，新生骨的密度(618.35±63.54 mgHA/cm3)和與正常骨密度(573.36±26.35mgHA/cm3)無顯著性差別，均明顯高于其他各組(p<0.05)。 4.直徑12mm的圓形犬眶內(nèi)側(cè)壁骨缺損在本研究觀察期內(nèi)無1例自行愈合。4w時，轉(zhuǎn)VEGF組形成的新生血管數(shù)量最多，但成骨量卻明顯少于雙轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染BMP2組。12w時BMP2+VEGF組和轉(zhuǎn)染BMP2組的成骨速度和新生骨量明顯高于其他組

9、(p<0.05)。24w時各組的成骨速度和骨組織內(nèi)的血管計數(shù)沒有統(tǒng)計學(xué)差異(p>0.05)。BMP2+VEGF組的新生骨體積(95.22±3.19％)接近骨缺損的體積，所形成骨組織的密度(691.15±97.15)與正常骨密度(749.15±67.08)沒有顯著性差異(p>0.05)。 結(jié)論： 1.外源基因VEGF165和BMP2基因?qū)隑MSCs后，BMSCs能夠高表達目的蛋白。 2.轉(zhuǎn)基因的BMSCs復(fù)合珊瑚

10、材料后，能夠在體外持續(xù)表達目的蛋白。不同比例的轉(zhuǎn)基因細胞構(gòu)建的組織工程骨的體內(nèi)血管生成和成骨能力不同，當轉(zhuǎn)VEGF和轉(zhuǎn)BMP2的細胞比為1:4時異位成骨的能力最強。 3.兔眶下緣12mm長的節(jié)段性骨缺損符合標準骨缺損的要求，BMP2+VEGF組的早期血管化和成骨能力均優(yōu)于單基因轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染基因組，16w時能夠修復(fù)眶下緣骨缺損。 4.犬的眼眶內(nèi)側(cè)壁與篩竇毗鄰，與人類的眼眶結(jié)構(gòu)相似，可作為研究臨床眶壁修復(fù)的實驗動物。直徑1