帶血管蒂的組織工程骨構(gòu)建及修復(fù)骨缺損的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的:
　　 組織工程技術(shù)為臨床骨缺損的治療提供了新的途徑,應(yīng)用組織工程技術(shù)在小型哺乳動(dòng)物體內(nèi)構(gòu)建骨組織,修復(fù)中、小尺寸的骨缺損的方法已基本成熟。但是對(duì)于大型哺乳動(dòng)物大范圍或受區(qū)血供不佳的骨缺損,由于移植物早期沒(méi)有獨(dú)立的血液供應(yīng),營(yíng)養(yǎng)滲透不足,骨痂形成緩慢、成骨效果不穩(wěn)定。如何建立有效的血液供應(yīng),促進(jìn)組織工程骨形成,縮短骨愈合時(shí)間是目前骨組織工程的研究重點(diǎn),也是制約組織工程骨大規(guī)模臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。為此,我們參考臨床常用的帶血

2、管蒂的腓骨移植術(shù)式,在比格犬體內(nèi)進(jìn)行帶血管蒂的組織工程骨構(gòu)建及修復(fù)骨缺損的研究；采用多種方法進(jìn)行血管化檢測(cè)；并應(yīng)用CT進(jìn)行長(zhǎng)期成骨量化評(píng)價(jià),對(duì)成骨過(guò)程中相關(guān)因素展開(kāi)深入探討,為應(yīng)用顯微外科技術(shù)進(jìn)行帶血管蒂的組織工程骨移植奠定大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 研究方法:
　　 1.體外構(gòu)建細(xì)胞支架復(fù)合物:
　　 髂骨穿刺抽取比格犬骨髓,應(yīng)用Ficoll-Paquc PluS液通過(guò)密度梯度離心分離BMSCs,擴(kuò)增、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)

3、BMSCs兩周,經(jīng)堿性磷酸酶、茜素紅、骨鈣素、骨橋蛋白染色確認(rèn)表達(dá)成骨細(xì)胞相關(guān)蛋白后,將誘導(dǎo)的BMSCs接種于帶凹槽的珊瑚一羥基磷灰石支架繼續(xù)體外培養(yǎng)一周,應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡、掃描電鏡觀察細(xì)胞在支架上生長(zhǎng)情況。
　　 2.體內(nèi)構(gòu)建含隱動(dòng)靜脈的組織工程骨,修復(fù)腓骨缺損:
　　 將細(xì)胞支架復(fù)合物植入比格犬下肢肌間隙,使隱動(dòng)靜脈血管嵌入支架的凹槽中,4周后應(yīng)用B超、CT血管造影、血管鑄型和組織學(xué)染色觀察血管化情況,應(yīng)用組織工

4、程復(fù)合物修復(fù)腓骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損。組織工程復(fù)合物共分4組:’VSC組(帶血管蒂的細(xì)胞支架)、SC組(細(xì)胞支架)、VS組(帶血管蒂的空白支架)、S組(空白支架),移植后1、3、6、9月應(yīng)用CT和組織學(xué)方法分別評(píng)估在異位成骨環(huán)境(肌間隙)和骨缺損環(huán)境(腓骨缺損)組織工程骨形成及支架降解情況。
　　 3.系統(tǒng)分析細(xì)胞、血管、微環(huán)境因素對(duì)組織工程骨形成和支架降解的影響:
　　 由于CT值與骨組織密度近似線性關(guān)系,能夠較精確反映骨骼的骨

5、量信息,我們用相對(duì)CT值代表新生的組織工程骨量,即VSC組平均CT值與VS組平均CT值相減所得值為VSC組相對(duì)CT值；SC組平均CT值與S組平均CT值相減所得值為SC組相對(duì)CT值,不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)CT值相減即為階段成骨量。應(yīng)用VS組和S組平均CT值評(píng)估支架降情況,不同時(shí)間點(diǎn)的平均CT值相減即為支架階段降解量。將四組支架在不同成骨環(huán)境下各時(shí)間點(diǎn)的CT值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較,分析細(xì)胞、血管、微環(huán)境因素對(duì)組織工程骨形成和支架降解的影響。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)

6、準(zhǔn)誤表示,采用spss17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.BMSCs—CHA復(fù)合物體外構(gòu)建:BMSCs在體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后可迅速增殖、分化,成骨誘導(dǎo)的第二代BMSCs高表達(dá)成骨細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物(堿性磷酸酶、茜素紅、骨鈣素、骨橋蛋白),接種CHA支架后貼壁生長(zhǎng)良好,迅速增殖并產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)。
　　 2.BMSCs—CHA復(fù)合物血管化檢測(cè):首次應(yīng)用B超、CT、血管

7、鑄型、組織學(xué)染色證實(shí)VSC組移植到下肢肌間隙內(nèi)四周后可形成含隱動(dòng)靜脈的脈管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),可進(jìn)行帶血管蒂移植。
　　 3.異位成骨環(huán)境成骨情況:組織學(xué)顯示VSC組3月后可見(jiàn)少量骨樣組織形成,6月后骨組織增多,9月后可見(jiàn)大量成熟骨組織,殘存少量支架。SC組3月后可見(jiàn)類骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu),未見(jiàn)明顯骨組織；6月可見(jiàn)類骨質(zhì)成熟形成骨組織,9個(gè)月可見(jiàn)骨組織進(jìn)一步增多,支架殘余較多。VS組和S組支架孔隙中填充纖維結(jié)締組織,支架表面有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),支架

8、逐步降解,無(wú)骨組織形成。
　　 4.骨缺損環(huán)境成骨情況:組織學(xué)和CT影像證實(shí)VSC組和SC組修復(fù)腓骨標(biāo)準(zhǔn)缺損,VSC組優(yōu)于SC組；而VS組和S組形成纖維骨不連。
　　 5.種子細(xì)胞對(duì)組織工程骨形成的影響:通過(guò)比較分析VSC和VS組、SC和S組平均CT值變化情況,發(fā)現(xiàn)在異位成骨環(huán)境和骨缺損成骨環(huán)境中,四組支架均形成鮮明對(duì)比,VSC、SC組平均CT值隨時(shí)間延長(zhǎng)逐步升高,形成組織工程骨,而VS、S組平均CT值隨時(shí)間延長(zhǎng)逐步減低

9、,支架降解,無(wú)組織工程骨形成。各時(shí)間點(diǎn)平均CT值均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 6.血管化對(duì)組織工程骨形成的影響:通過(guò)分析VSC和SC組支架相對(duì)CT值變化情況,發(fā)現(xiàn)在異位成骨環(huán)境和骨缺損成骨環(huán)境中,兩組支架均有相似的變化趨勢(shì),均隨時(shí)間逐步升高,不同時(shí)間點(diǎn)VSC組成骨量(相對(duì)CT值)高于SC組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；但不同時(shí)間段內(nèi)階段成骨量(相對(duì)CT值之差)比較,僅0-3月有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 7.血管化對(duì)CHA支架降解的影響:通過(guò)分

10、析VS和S組支架CT值變化情況,發(fā)現(xiàn)在異位成骨環(huán)境和骨缺損成骨環(huán)境中,兩組支架均有相似的變化趨勢(shì),均隨時(shí)間逐步降低,除1月外,各時(shí)間點(diǎn)VS組平均CT值低于S組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；但不同時(shí)間段內(nèi)支架階段降解量(平均CT值之差)比較,僅0—3月有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 8.微環(huán)境對(duì)組織工程骨形成的影響:通過(guò)分析SC組在不同成骨環(huán)境相對(duì)CT值變化,發(fā)現(xiàn)在骨缺損成骨環(huán)境中各時(shí)間點(diǎn)成骨量(相對(duì)CT值)高于異位成骨環(huán)境,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；但不同時(shí)間

11、段內(nèi)階段成骨量(相對(duì)CT值之差)比較,0—3月、6—9月有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 9.微環(huán)境對(duì)CHA支架降解的影響:通過(guò)分析S組在不同成骨環(huán)境平均CT值變化,發(fā)現(xiàn)在骨缺損成骨環(huán)境中各時(shí)間點(diǎn)平均CT值低于異位成骨環(huán)境,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；不同時(shí)間段內(nèi)支架階段降解量(平均CT值之差)比較,各時(shí)間段均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論:
　　 1.在大動(dòng)物比格犬異位成骨環(huán)境成功構(gòu)建帶血管蒂的組織工程骨。帶血管蒂的細(xì)胞支架復(fù)合物在體內(nèi)4

12、周后可以形成含隱動(dòng)靜脈的脈管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),3月后支架表面可見(jiàn)少量組織工程骨的形成,9月后可見(jiàn)含哈弗氏系統(tǒng)樣的組織工程骨,帶血管蒂組織工程骨的形成進(jìn)程明顯快于無(wú)血管蒂組,相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道。
　　 2.應(yīng)用帶血管蒂的組織工程骨成功修復(fù)比格犬腓骨缺損,同時(shí)建立組織工程骨體內(nèi)血管化研究的大動(dòng)物模型。本模型修復(fù)鄰近骨缺損無(wú)需顯微外科吻合,避免了吻合血管固有的失敗率；修復(fù)遠(yuǎn)處骨缺損可應(yīng)用顯微外科移植技術(shù)。帶血管蒂的組織工程骨為構(gòu)建大體積組織工程