KLF4和miR27b在血管疾病中的功能和分子機(jī)制的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行論述：
　　第一章:KLF4在HRMECs中的功能和分子機(jī)制的研究
　　目的：
　　血管再生是發(fā)育過程中已有血管生成新血管的生理過程，在胚胎發(fā)育過程中具有重要的作用。人們廣泛地研究了血管再生在很多疾病中的治療效果，通過抑制血管生成或者促新血管生成藥物來控制血管再生。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種血管增生因子。通過激活VEGF信號通路，可有效促進(jìn)血管再生。在臨床上，VEGF抗體或者VEGF受

2、體(VEGFR)激酶抑制劑哌加他尼鈉、蘭尼單抗及貝伐單抗等已被批準(zhǔn)應(yīng)用，用來治療癌癥、年齡相關(guān)性黃斑變性及糖尿病性視網(wǎng)膜病變。雖然在治療過程中出現(xiàn)了一定的療效，但一些副作用依然頻發(fā)，如:慢性皮膚型紅斑狼瘡及眼內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)淋巴瘤等。因此，還需要對VEGF信號通路在這些疾病中的作用規(guī)律進(jìn)行進(jìn)一步的研究。轉(zhuǎn)錄因子Krüppel樣因子4(KLF4)，是能夠?qū)⒊赡晷图?xì)胞重編成誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)的四大因子之一;在重新編碼過程中

3、，KLF4通過抑制上皮向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(EMT)而發(fā)揮著作用。KLF4作用下的EMT與腫瘤轉(zhuǎn)移存在一定的關(guān)聯(lián)，對此人們已在幾種人類癌癥中進(jìn)行廣泛的研究。通過瞄準(zhǔn)VEGF通路，EMT可促進(jìn)血管再生。在維持內(nèi)皮祖細(xì)胞表型的過程中，KLF4是關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子;通過激活A(yù)KT通路，白血病抑制因子和血管內(nèi)皮生長因子能夠上調(diào)KLF4。最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，KLF4通過調(diào)節(jié)miR-15a來抑制細(xì)胞周期蛋白D1，削弱內(nèi)皮細(xì)胞中的管狀形成。然而另外一項(xiàng)調(diào)查結(jié)

4、果則顯示，通過調(diào)節(jié)notch信號通路KLF4能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞中的血管再生。在基因表達(dá)譜上，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)和人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HRMECs）各自具有不同的特性。轉(zhuǎn)錄因子Krüppel-like factor4(KLF4)對人類細(xì)胞的細(xì)胞增殖、遷移和分化起到了調(diào)節(jié)的作用，并且是誘導(dǎo)干細(xì)胞重組的四個(gè)因素之一，然而，它在眼部新生血管性疾病中的作用還沒有探明。本實(shí)驗(yàn)的目的是探討其在HRMECs血管生成中的作用和潛在的分子機(jī)

5、制。
　　方法：
　　細(xì)胞培養(yǎng):HRMECs在Cell Systems(Kirkland，WA)購買，Medium131作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中加入了10％的FBS，1％的微血管生長因子添加劑，10μg/ml慶大霉素，100 U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素。在37℃5％的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所有的實(shí)驗(yàn)都在細(xì)胞培養(yǎng)五代之內(nèi)進(jìn)行。慢病毒載體的構(gòu)建:本課題中，KLF4過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建參照分子克隆的標(biāo)準(zhǔn)方法完成。KLF4

6、shR1和KLF4shR2在GE Dharmacon(Lafayette，CO)購買。shRNA作用KLF4的目標(biāo)序列為5'GCTCCATTACCA AGA GCTCAT(KLF4shR1)和5'GCCAGAATTGGACCCG GTGTA(KLF4shR2)，對照pLKO1-scrambe(＃1864)在Addgene(Cambridge，MA)購買。HEK293FT細(xì)胞包裝慢病毒。純化后的慢病毒轉(zhuǎn)染HRMECs，3μg/ml嘌呤霉素

7、篩選轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的細(xì)胞。MTT分析:96孔板每孔接種5000個(gè)細(xì)胞，含1％FBS的培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)12小時(shí)后VEGF(50ng/ml)處理。此后，96孔板中，每個(gè)孔加入10μl MTT反應(yīng)物，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4小時(shí)后加入100μl的detergent來終止反應(yīng)，測量570 nm的OD值來反映細(xì)胞的增殖情況。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn):使用購買于BD Science(Franklin Lakes，NJ)公司的細(xì)胞遷移室進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞遷移室置入24孔

8、板內(nèi)。300μL M131中包含2×104個(gè)細(xì)胞，加入到每個(gè)遷移室的上部。終濃度為50 ng/ml的VEGF作為誘導(dǎo)因子添加到每個(gè)小室的底部。培養(yǎng)基和未遷移的細(xì)胞被隔離在小室的上層，內(nèi)置遷移室的24孔板培養(yǎng)在5％二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)12小時(shí)。在薄膜底部遷移的細(xì)胞用甲醇固定，結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡拍攝圖片。遷移細(xì)胞數(shù)從三個(gè)不同的區(qū)域統(tǒng)計(jì)，計(jì)算遷移率。血管形成分析:基底膜基質(zhì)TM(BD Biosciences)在4℃過夜解凍，在每個(gè)96孑L板中

9、加入60μl。聚合反應(yīng)的條件是37℃，30 min。無VEGF處理的細(xì)胞在M131培養(yǎng)基中重懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量后接種在凝膠的上部，細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)8小時(shí)。每孔中選擇3個(gè)視野計(jì)算管狀結(jié)構(gòu)的分支點(diǎn)和分枝數(shù)，分析作圖。熒光素酶報(bào)告基因分析:1.5kb和0.2 kb Vegf啟動(dòng)子報(bào)告載體和帶有KLF4 Tet-on的慢病毒載體共同轉(zhuǎn)染HRMECs，PSV40 Rellina質(zhì)粒作為內(nèi)參質(zhì)粒。1 ug/ml DOX誘導(dǎo)KLF4表達(dá)。firefly熒

10、光素酶和renilla熒光素酶底物在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)后分別測量，計(jì)算firefly熒光素酶和renilla熒光素酶表達(dá)的比例。免疫熒光染色:為檢驗(yàn)HRMECs中VEGF和KLF4的表達(dá)，KLF4表達(dá)細(xì)胞和對照組細(xì)胞用4％ PFA固定10分鐘，含0.1％ Tween20的PBS洗3次，封閉液（5％的正常山羊血清，3％牛血清白蛋白，包含0.1％ Triton-X100的PBS）孵育1小時(shí)。VEGF和KLF4的抗體稀釋液孵育過夜，PBST沖洗3

11、次×5分鐘后，室溫下，二抗稀釋液孵育1小時(shí)。DAPI進(jìn)行細(xì)胞核復(fù)染色，尼康倒置熒光顯微鏡采集圖像。Western Blot: HRMECs總蛋白的提取，取等量的蛋白(30μ g/lane)進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，然后將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，封閉膜，一抗二抗孵育膜，在sigma公司(St.Louis，MO)購買GAPDH的一抗，在Cell Signaling購買P-ERK1/2，P-AKT，p-VEGFR2的一抗。
　　結(jié)論

12、：
　　KLF4結(jié)合Vegf啟動(dòng)子區(qū)域，上調(diào)Vegf表達(dá)。
　　KLF4增強(qiáng)HRMECs中VEGF介導(dǎo)的信號通路，激活VEGFR2和下游ERK1/2、AKT信號通路。
　　KLF4促進(jìn)HRMECs的增殖、遷移和微管形成。
　　第二章:miR-27b在MVSMCs中的功能和分子機(jī)制的研究
　　目的：
　　近年來，miRNA是生物學(xué)研究的熱點(diǎn)，生物體內(nèi)許多生理、病理過程都與miRNA直接相關(guān)。miRNA在

13、進(jìn)化過程中具有高度保守的特點(diǎn)，是一種內(nèi)源性非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因的表達(dá)，參與生物的代謝，并且在代謝中發(fā)揮重要作用。miRNA在促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)表型變化的過程中，發(fā)揮著重要的功能，但對其發(fā)揮功能的內(nèi)在分子機(jī)制，依然不是十分明確。編碼miR-27b的基因位于第9染色體，在人類和小鼠中，miR-27b基因序列保守，在腫瘤中的研究表明，miR-27b對胃癌細(xì)胞的生長和遷移具有抑制作用，但對乳腺癌和宮頸癌細(xì)胞的增殖有促

14、進(jìn)作用。在正常的生理情況下，miR-27b調(diào)節(jié)肌肉脂肪細(xì)胞的分化，在肝脂肪細(xì)胞的遷移中發(fā)揮重要作用，在血管生成過程中，miR-27b促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)血管的新生。本實(shí)驗(yàn)的目的是探討miR-27b在MVSMCs中的功能和發(fā)揮作用的潛在分子機(jī)制。
　　方法：
　　細(xì)胞培養(yǎng)、MTT分析、熒光素酶報(bào)告基因分析、transwell遷移實(shí)驗(yàn)、慢病毒包裝、免疫熒光染色、western blot的實(shí)驗(yàn)方法參見第一章。
　　

15、結(jié)論：
　　miR-27b在MVSMCs是一個(gè)控制細(xì)胞增殖和遷移的因子，被PDGF所調(diào)控，過表達(dá)miR-27b對MVSMCs的增殖和遷移有促進(jìn)的作用，敲低miR-27b對MVSMCs的增殖和遷移有抑制的作用，過表達(dá)miR-27b對MVSMCs的凋亡有抑制的作用，敲低miR-27b對MVSMCs的凋亡有促進(jìn)的作用。對于其作用機(jī)制的研究表明，過表達(dá)miR-27b下調(diào)MVSMCs標(biāo)記性基因sma的表達(dá)，敲低miR-27b對其表達(dá)有上調(diào)的