甘露糖化咪唑化羧甲基殼聚糖與依替膦酸復(fù)合物納米粒在動(dòng)物體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)的初步研究.pdf

1、目的:本研究采用皮下種植H22肝癌細(xì)胞的方法制作Balb/c小鼠腫瘤模型，并采用免疫組化法觀察模型小鼠中腫瘤組織的TAMS聚集情況。前期研究中已發(fā)現(xiàn)的甘露糖化殼聚糖納米粒具有與甘露糖受體特異性結(jié)合的能力，在本研究初步了解納米藥物在小鼠體內(nèi)的安全劑量，評(píng)價(jià)該納米藥物在模型小鼠的組織分布、對(duì)模型小鼠的抑瘤效果，進(jìn)一步在細(xì)胞水平探討該納米顆?？鼓[瘤的作用機(jī)制。
　　方法:1、模型小鼠的制作:將H22肝癌細(xì)胞注入balb/c小鼠腹腔，取腹

2、水離心后生理鹽水重懸1×107/ml，移植于小鼠左側(cè)腹股溝皮下，每只0.2ml，皮下形成腫瘤的小鼠即為模型小鼠。2、模型小鼠癌巢周圍巨噬細(xì)胞聚集情況:采用免疫組化染色方法，用CD68抗體、CD163抗體分別標(biāo)記腫瘤病灶的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞TAMS、M2型巨噬細(xì)胞，在光學(xué)顯微鏡觀察腫瘤組織陽性染色細(xì)胞的聚集情況。3、納米藥物的安全劑量實(shí)驗(yàn):設(shè)計(jì)三個(gè)梯度的納米藥物實(shí)驗(yàn)組，尾靜脈注射納米藥物濃度分別為:1g/kg、500mg/kg、200mg/

3、kg，生理鹽水組為對(duì)照組，給藥后7天內(nèi)記錄小鼠的有無死亡，觀察小鼠的飲食、活動(dòng)及體重變化情況，評(píng)價(jià)安全性，尋找后期實(shí)驗(yàn)的用藥劑量。4、納米藥物在模型小鼠體內(nèi)的組織分布:模型小鼠分別在尾靜脈推入納米藥物后3小時(shí)、24小時(shí)、72小時(shí)剖出心、肝、脾、肺、腎、腫瘤，行快速冰凍切片，通過熒光顯微鏡觀察組織中熒光強(qiáng)弱并記錄熒光值。5、納米藥物的抑瘤實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)高、中、低濃度納米藥物實(shí)驗(yàn)組(MICE)，生理鹽水組和空白納米組做為陰性對(duì)照組，干擾素組

4、為陽性對(duì)照組，移植后第二天予不同藥物處理，在用藥后21天內(nèi)記錄各組小鼠腫瘤生長(zhǎng)的體積變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，剖檢各組剩余小鼠的腫瘤，稱重和測(cè)量體積，并計(jì)算各組小鼠的腫瘤體積抑制率和腫瘤質(zhì)量抑制率。重復(fù)實(shí)驗(yàn)，記錄在用藥后30天內(nèi)各組小鼠的存活數(shù)量。6、納米藥物對(duì)癌巢中免疫細(xì)胞影響:實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了納米藥物組、干擾素組、空白納米顆粒組、生理鹽水組，移植后第二天予不同藥物處理，皮下種植模型后15天實(shí)驗(yàn)結(jié)束，眼底靜脈采血并剖出小鼠的腫瘤組織，腫瘤組織用機(jī)械法

5、制作單個(gè)細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)靜脈血和腫瘤組織中CTL、Treg、M1、M2型巨噬細(xì)胞的比例。
　　結(jié)果:1、小鼠在皮下種植后第8天，捫及有腫瘤形成，表明模型建立成功。2、腫瘤免疫組化結(jié)果:腫瘤實(shí)質(zhì)和間質(zhì)均有TAMS和M2型巨噬細(xì)胞聚集，其中腫瘤間質(zhì)聚集的TAMS、M2型巨噬細(xì)胞多于腫瘤實(shí)質(zhì)。3、動(dòng)物的藥物安全劑量實(shí)驗(yàn)結(jié)果:在7天的觀察期間，三個(gè)濃度梯度的納米藥物實(shí)驗(yàn)組的一般情況可，未觀察到明顯藥物毒性。剖檢實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的

6、重要臟器，臟器的顏色、形態(tài)均無明顯差別，藥物的安全性較好，提示后期實(shí)驗(yàn)的用藥劑量在1g/kg以內(nèi)。4、納米藥物在模型小鼠的組織分布結(jié)果:心臟在用藥后3小時(shí)、24小時(shí)、72小時(shí)和空白對(duì)照組的熒光值相近，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用藥后3小時(shí)的肝、脾、肺、腎、腫瘤平均熒光值均大于對(duì)應(yīng)的空白對(duì)照組(P＜0.01);用藥后24小時(shí)，只有肝、腎、腫瘤的平均熒光值高于空白對(duì)照組(P＜0.01);用藥后72小時(shí)，僅腫瘤的平均熒光值高于空白對(duì)照組(P＜0.01)。

7、5、納米藥物的抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果:高濃度納米組的成瘤時(shí)間晚于其他五組，成瘤后各組小鼠腫瘤體積變化有明顯差異，其中高濃度納米組瘤體生長(zhǎng)緩慢，其余五組腫瘤生長(zhǎng)速度較快。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，高濃度組腫瘤體積明顯小于其他五組(P＜0.01)。高濃度納米組的腫瘤體積抑制率和腫瘤質(zhì)量抑制率較高，可達(dá)到80％以上;其他五組的腫瘤體積抑制率和腫瘤質(zhì)量抑制率相差不大，均低于30％。實(shí)驗(yàn)期間，高濃度納米組零死亡，其他組均出現(xiàn)模型小鼠死亡事件，提示高濃度納米藥物對(duì)腫瘤的抑

8、制效果明顯。6、流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果:腫瘤組織檢測(cè)結(jié)果:與生理鹽水組對(duì)比，納米藥物組的免疫抑制性細(xì)胞M2和Treg比例下降，免疫增強(qiáng)的細(xì)胞M1和CTL細(xì)胞比例升高。干擾素組的免疫抑制性細(xì)胞Treg和M2比例升高，免疫增強(qiáng)的細(xì)胞CTL細(xì)胞比例升高、M1降低;空白納米組與生理鹽水的免疫細(xì)胞比例相近。靜脈血檢測(cè)結(jié)果:與生理鹽水組對(duì)比，納米藥物組的免疫抑制性細(xì)胞Treg比例升高、M2相近，免疫增強(qiáng)的細(xì)胞M1和CTL比例升高;干擾素組的免疫抑制性細(xì)

9、胞Treg比例升高、M2相近，免疫增強(qiáng)的細(xì)胞M1和CTL比例升高;空白納米組的免疫抑制性細(xì)胞Treg比例升高、M2相近，免疫增強(qiáng)的細(xì)胞CTL比例升高、M1降低。
　　結(jié)論:1、模型小鼠腫瘤組織中聚集有大量的TAMS、M2型巨噬細(xì)胞，具備腫瘤免疫治療的動(dòng)物模型條件;2、納米藥物的安全劑量范圍至少在1g/kg以內(nèi);3、納米藥物能夠靶向聚集到腫瘤組織，且維持時(shí)間較長(zhǎng);4、高濃度納米藥物(500mg/kg)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有明顯的抑制效果;5、