羧甲基纖維素-殼聚糖復(fù)合物的制備及對(duì)乳糖酶的固定化研究.pdf

1、乳糖酶的缺乏是引起乳糖不耐癥的主要原因,而利用固定化乳糖酶水解奶中的乳糖,是解決乳糖不耐癥的主要方法。本研究主要以羧甲基纖維素(簡(jiǎn)稱CMC)和殼聚糖(CS)為原料,分別制備了羧甲基纖維素-殼聚糖聚電解質(zhì)復(fù)合物(簡(jiǎn)稱CMC-CS)、氧化羧甲基纖維素-殼聚糖復(fù)合物(簡(jiǎn)稱氧化CMC-CS)和氧化羧甲基纖維素酯(簡(jiǎn)稱氧化CMC酯)三種固定化酶的載體,并對(duì)乳糖酶進(jìn)行固定化,優(yōu)化載酶條件,對(duì)其特性進(jìn)行了研究;同時(shí)還探討了CMC-CS聚電解質(zhì)復(fù)合物的

2、成膜性,測(cè)定了其對(duì)金屬離子的吸附性能,研究了其吸附作用機(jī)制。本課題是高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào):20060225008)和東北林業(yè)大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目中的部分內(nèi)容。
　　 首先在酸性條件下,通過共混的方式,制各了CMC-CS復(fù)合物,并通過FTIR、X-RD、SEM和DSC對(duì)其分子問的作用機(jī)理進(jìn)行探討,研究結(jié)果表明CMC-CS之間并不是以其中任一種組分為骨架的單純的混合,而是產(chǎn)生了靜電作用與氫鍵作用,生成了

3、聚電解質(zhì)復(fù)合物。并制備了三種不同比例(1/2,1/1,2/1)的CMC-CS膜,測(cè)定得出:當(dāng)CMC和CS的比例為1:1時(shí),靜電作用和氫鍵作用最大,拉伸強(qiáng)度可達(dá)34.44 Mpa,比殼聚糖單膜強(qiáng)度提高了64.47％;羧甲基纖維素的加入,使得酸性適用范圍下限由CS膜的pH=5降至pH=4,在pt=6中浸泡一段時(shí)間后,測(cè)得力學(xué)強(qiáng)度為25.71 Mpa;CMC-CS膜的吸水溶脹性顯著降低;在170℃～330℃,共混膜分子間發(fā)生降解,當(dāng)溫度為21

4、7.4℃時(shí),靜電力消失,離子鍵斷裂。CMC-CS共混膜對(duì)Pb2+的飽和吸附量為213.76μg/cm2,靜態(tài)吸附Cu2+量為231.25μg/cm2,動(dòng)態(tài)吸附Cu2+量為24.05μg/cm2。
　　 又以CMC-CS聚電解質(zhì)復(fù)合物為載體,戊二醛為交聯(lián)劑,制備了固定化乳糖酶,優(yōu)化了固定化條件,分析了固定化酶的性能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:當(dāng)戊二醛體積濃度為0.5％,酶液質(zhì)量濃度為1 mg/mL,固定9 h,交聯(lián)3 h時(shí),固定化效果最好,活

5、力為0.0235U/g;固定化酶最適反應(yīng)溫度50℃,pH值為7,游離酶的最適溫度為30℃,pH值為9;固定化酶的pH值穩(wěn)定性優(yōu)于游離酶,熱穩(wěn)定性低于游離酶;重復(fù)使用3次時(shí),穩(wěn)定性較好;固定化米氏常數(shù)Km為0.7051 mmol/L,較游離酶有所減小,表明底物與固定化酶親和力增加,利于酶促反應(yīng)進(jìn)行。
　　 其次以CMC為原料,高碘酸鈉為氧化劑,酸性條件下,制備了氧化CMC-CS復(fù)合物,采用FTIR和DSC分析對(duì)氧化CMC-CS復(fù)合

6、物的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征,表明氧化CMC-CS中CMC上2,3位的羥基被成功氧化,生成醛基,并且氧化CMC和CS溶液在混合時(shí)生成聚電解質(zhì)復(fù)合物,兩者以離子鍵作用存在。以氧化CMC-CS為載體制備了固定化乳糖酶,固定化酶最高活力,可達(dá)到0.1156 U/g,固定化酶在低溫時(shí),穩(wěn)定性較好,但在高溫下,固定化酶的穩(wěn)定性較差。固定化酶活力隨pH值的升高先增加后降低。固定化酶在重復(fù)使用六次后,基本保持不變。通過米氏常數(shù)比較得出,以氧化CMC-CS為載

7、體的固定化酶的米氏常數(shù)要小于游離酶米氏常數(shù),說明酶促反應(yīng)更容易進(jìn)行。
　　 最后以CMC為原料,環(huán)氧氯丙烷為交聯(lián)劑,高碘酸鈉為氧化劑,通過選擇性氧化反應(yīng)制備氧化CMC酯。通過FTIR、X-RD、DSC以及化學(xué)官能團(tuán)測(cè)定(堿熔法測(cè)醛基含量)等手段對(duì)氧化CMC酯的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征,并研究了以氧化CMC酯為載體,固定化乳糖酶的性能。單因素實(shí)驗(yàn)表明氧化CMC酯合成的較佳條件為:高碘酸鈉與酯化CMC的質(zhì)量比為2,反應(yīng)溫度為40℃,反應(yīng)時(shí)間為2

8、 h,反應(yīng)介質(zhì)的pH為2,此時(shí)氧化CMC酯的醛基含量為80.67％。CMC通過酯化后,羧基轉(zhuǎn)變?yōu)轷セ?經(jīng)過氧化后,產(chǎn)物中含有醛基;溶解性能測(cè)定分析表明,酯化CMC和氧化CMC酯均不溶于一般有機(jī)溶劑中。當(dāng)酶濃度為1.0 mg/mL,固定6 h時(shí),固定化乳糖酶活力最高,可達(dá)到0.0771U/g:固定化酶的熱穩(wěn)定性要優(yōu)于游離酶;以氧化CMC酯為載體的固定化乳糖酶的pH穩(wěn)定性比游離酶有很大的提高,pH穩(wěn)定性介于以CMC-CS和氧化CMC-CS為