病毒樣顆粒包裝鋅指核酶形成假病毒及其對(duì)HPV16陽(yáng)性細(xì)胞的殺傷研究.pdf

1、目的：
　　1.前期工作中已經(jīng)通過(guò)分析HPV16中癌基因E7的序列信息，并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建靶向于不同靶點(diǎn)的鋅指核酶質(zhì)粒，利用體外的報(bào)告體系初步篩選出切割效率最好而毒副作用最小的ZFNs對(duì)，同時(shí)通過(guò)對(duì)ZFN的切割域和骨架系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，篩選出切割效率最高的ZFN對(duì)，此項(xiàng)工作已經(jīng)在前期完成。
　　2.建立VLPs假病毒感染細(xì)胞的陽(yáng)性體系。通過(guò)應(yīng)用HPV16的VLPs包裝PrwB紅光質(zhì)粒，得到VLP-PrwB的假病毒。產(chǎn)生的假病毒進(jìn)行

2、收獲及純化，純化后的產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)染各個(gè)細(xì)胞系，通過(guò)紅光的觀察來(lái)驗(yàn)證VLPs-PrwB假病毒的感染效率。包裝純化后的VLPs-PrwB可以作為后期包裝的陽(yáng)性對(duì)照。
　　3.將ZFN目的片段取代PrwB的紅光序列，構(gòu)建到PrwB載體上，形成的質(zhì)粒用VLPs進(jìn)行包裝，包裝后的產(chǎn)物進(jìn)行收獲以及純化，然后純化產(chǎn)物對(duì)不同細(xì)胞進(jìn)行感染，驗(yàn)證ZFNs對(duì)HPV16 E7的切割效果。
　　方法：
　　1.前期實(shí)驗(yàn)中已得切割效率最好而毒副作用

3、最小的ZFN對(duì)ZFN-L和ZFN-R。
　　2.構(gòu)建VLPs包裝的陽(yáng)性質(zhì)粒：用p16L1L21質(zhì)粒和PrwB質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝工具細(xì)胞293FT。轉(zhuǎn)染的p16L1L2質(zhì)粒在293FT中表達(dá)出L1和L2蛋白，并且組裝成HPV16的衣殼。衣殼組裝過(guò)程中，將目的質(zhì)粒PrwB包裝進(jìn)入衣殼中形成VLP-PrwB假病毒。包裝好的VLP-PrwB假病毒進(jìn)行收集及純化。純化后的VLP-PrwB假病毒感染293細(xì)胞確定感染的有效滴度。確定滴度后的 VL

4、P-PrwB假病毒感染 SiHa， HeLa，C33-a和293等細(xì)胞后，觀察其中紅光的發(fā)光效率的方法確定其感染效率。
　　3.通過(guò)對(duì)之前驗(yàn)證針對(duì) HPV16 E7有效的鋅指核酶目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，連接構(gòu)建到PrwB的骨架載體上，分別命名為ZFN-L和ZFN-R。
　　4.構(gòu)建VLPs包裝ZFN-L和ZFN-R：用p16L1L2質(zhì)粒和ZFN-L和ZFN-R質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝工具細(xì)胞293FT。p16L1L2質(zhì)粒在293FT中表達(dá)出

5、L1和L2蛋白包裝ZFN-L和ZFN-R質(zhì)粒形成VLP-ZFN-L和VLP-ZFN-R假病毒。包裝好的VLP-ZFN-L和VLP-ZFN-R假病毒進(jìn)行收集及純化。純化后的 VLP-ZFN-L和 VLP-ZFN-R假病毒對(duì)SiHa，HeLa以及C33-a細(xì)胞進(jìn)行感染。（1）T7E1實(shí)驗(yàn)檢測(cè)經(jīng)VLP-ZFN-L和VLP-ZFN-R假病毒共同感染的細(xì)胞系中DNA是否存在有DNA被切割形成雙鏈斷裂（double strandes break，D

6、SB）并導(dǎo)致同源重組（homologous recombination， HR）以及非同源性末端連接（Non-homologous end joining， NHEJ）。（2）細(xì)胞凋亡可以顯示VLP-ZFN-L和VLP-ZFN-R假病毒共同感染細(xì)胞之后，細(xì)胞的凋亡情況。（3）克隆形成實(shí)驗(yàn)可以通過(guò)VLP-ZFN-L和VLP-ZFN-R假病毒感染細(xì)胞之后，通過(guò)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化以及種植到孔板后，觀察細(xì)胞克隆的形成個(gè)數(shù)從而得到假病毒對(duì)細(xì)胞的增殖能

7、力的影響。（4）western blotting檢測(cè)VLP-ZFN-L和VLP-ZFN-R假病毒感染細(xì)胞之后細(xì)胞中HPV16的E6，E7蛋白以及和E7相互作用的pRb蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.利用VLPs包裝的PrwB質(zhì)粒形成的VLP-PrwB假病毒，經(jīng)過(guò)收獲以及純化之后，能使得感染的細(xì)胞發(fā)紅光。說(shuō)明VLPs包裝PrwB質(zhì)粒形成的VLP-PrwB假病毒能夠感染細(xì)胞，并且其中包裝的質(zhì)?？梢栽谒拗骷?xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。成功建立

8、VLPs包裝質(zhì)粒形成假病毒的體系，以及作為包裝其他質(zhì)粒形成假病毒的陽(yáng)性對(duì)照。
　　2. VLP-ZFN-L和VLP-ZFN-R假病毒一起感染SiHa，HeLa和C33-a，其中的ZFN質(zhì)粒能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出相應(yīng)蛋白，形成鋅指核酶的識(shí)別序列以及切割序列，有效的切割DNA靶序列，從而引起：（1）HPV16 E7的序列形成DSB，繼而激活細(xì)胞內(nèi)DNA的修復(fù)機(jī)制，從而導(dǎo)致HR以及NHEJ。這種效果在HeLa和C33-a中并沒(méi)有出現(xiàn)，說(shuō)明

9、鋅指核酶切割的特異性。（2）VLP-ZFNs感染導(dǎo)致SiHa細(xì)胞的凋亡增加，但是HeLa和C33-a中并沒(méi)有出現(xiàn)明顯的凋亡。（3）VLP-ZFNs感染細(xì)胞之后，SiHa細(xì)胞的克隆形成明顯減少，但是對(duì)HeLa和C33-a的克隆形成的影響并不大。（4）western blotting檢測(cè)HPV16的E6，E7及相關(guān)蛋白時(shí)候發(fā)現(xiàn)，假病毒感染的SiHa細(xì)胞E7蛋白量表達(dá)下降，pRb蛋白表達(dá)量上升，而HeLa和C33-a的變化不大。
　　討

10、論：
　　1.綜上所述，通過(guò)對(duì)VLP-PrwB假病毒進(jìn)行包裝，證實(shí)VLP可以攜帶目的質(zhì)粒形成假病毒。這種假病毒可以感染目的細(xì)胞，并使目的基因在靶細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。證明了VLP包裝形成假病毒的可行性以及該體系的建立，為后期的實(shí)驗(yàn)建立了陽(yáng)性對(duì)照。
　　2.通過(guò)VLP包裝ZFNs形成VLP-ZFNs假病毒，這種假病毒可以感染SiHa細(xì)胞，并且其中的ZFNs可以在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，ZFNs表達(dá)形成的蛋白可以針對(duì)特定序列進(jìn)行切割，本實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)的