肌腱鈣化的相關研究.pdf

1、肌腱鈣化為臨床中常見疾病，常并發(fā)于肌腱損傷或手術之后，或作為肌腱病的一種特殊表現(xiàn)形式。本課題旨在對肌腱鈣化的發(fā)病機制及防治做一從基礎到臨床相關的系統(tǒng)性研究。旨在提高對于肌腱鈣化的基礎認識，從而指導臨床治療。
　　第一章 肌腱鈣化動物模型的建立及驗證
　　目的:評價跟腱切斷誘導的肌腱鈣化模型是否穩(wěn)定可靠，為之后采用該模型進行研究提供依據(jù)。
　　方法:采用C57小鼠，麻醉后在無菌條件下在右后跟處皮膚做一約1厘米的縱向切口，

2、暴露肌膜及跟腱。在跟腱中段橫斷跖肌腱及跟腱，縫合皮膚。術后放回籠中自由活動。術后10周時處死小鼠行小動物CT檢測鈣化體積。并行HE及阿爾新藍染色明確組織學變化。
　　結果:術后1周時跟腱中段可見大量炎性細胞浸潤，可見少數(shù)肌腱細胞，細胞外基質較少。術后4周時，炎性細胞基本消失，取而代之的為大量肌腱細胞，細胞外基質較1周時明顯增加，但細胞及新生肌腱結構排列紊亂。術后6周時，未見明顯炎性細胞，細胞外基質較繼續(xù)增加，但細胞及新生肌腱結構仍

3、排列紊亂。術后10周時，可見較為完整的肌腱結構，細胞外基質明顯增加，細胞及新生肌腱結構排列整齊。
　　結論:通過組織學觀察證實了跟腱切斷誘導的肌腱鈣化為典型的插入部肌腱鈣化，且其病理過程為軟骨內成骨。本研究通過比較4組小鼠術后10周肌腱鈣化的體積大小發(fā)現(xiàn)各組間骨化體積大小無統(tǒng)計學差異，證明跟腱切斷誘導的肌腱鈣化模型穩(wěn)定且重復性好，可繼續(xù)用于之后的各項研究。
　　第二章 肌腱鈣化進行性發(fā)展并影響肌腱生物力學強度
　　目的

4、:對肌腱鈣化定性，明確其是否為進展性疾病，并明確肌腱鈣化是否影響肌腱生物力學強度。
　　方法:采用C57小鼠，麻醉后在無菌條件下在右后跟處皮膚做一約1厘米的縱向切口，暴露肌膜及跟腱。在跟腱中段橫斷跖肌腱及跟腱，縫合皮膚。術后放回籠中自由活動。術后10周及6個月時處死小鼠行小動物CT檢測鈣化體積并行生物力學測試。同時行HE及阿爾新藍染色明確組織學變化。
　　結果:μCT結果顯示術后10周及6個月時，手術側肌腱均發(fā)生肌腱鈣化，鈣

5、化位于肌腱的骨-腱結合側及肌腱-肌肉結合處。術后10周及六個月時在肌腱的骨-腱結合處均發(fā)現(xiàn)了骨化組織，在骨化區(qū)周圍伴有大量軟骨樣細胞且可以被阿爾新藍陽染。在肌肉-肌腱結合側我們發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。
　　結論:通過觀察造模后10周及6個月小鼠的鈣化體積及生物力學變化，我們發(fā)現(xiàn)肌腱鈣化為進展性疾病且損害肌腱生物力學強度，未來探索預防肌腱鈣化的藥物尤為必要。
　　第三章 損傷源性肌腱祖細胞的提取及相關研究
　　目的:明確肌腱損傷后

6、參與肌腱鈣化發(fā)生的干/祖細胞，為預防肌腱鈣化提供新的細胞水平治療靶點。
　　方法:將小鼠行跟腱切斷后1周安樂死后取其跟腱，將肌腱充分切碎，加入肌腱消化液，置于37℃水浴中震蕩消化1小時。將分離下來的細胞接種到100mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)后對細胞進行培養(yǎng)，觀察克隆形成，進行干細胞鑒定并行多能分化誘導。將小鼠安樂死后取其跟腱，消化后提取肌腱干/祖細胞，并行與上述損傷肌腱相同處理。
　　結果:原代培養(yǎng)10天后，我們對克隆形成數(shù)進行計數(shù)

7、，結果發(fā)現(xiàn)從正常肌腱及損傷后肌腱中提取的細胞均可以形成克隆。但從損傷后肌腱中提取的細胞克隆形成數(shù)量明顯多于正常肌腱，差異具有統(tǒng)計學意義（正常肌腱:0.
　　結論:本研究中我們采用跟腱切斷誘導的肌腱鈣化模型進行研究，在肌腱損傷后1周提取新生肌腱的局部細胞。我們的結果表明:肌腱損傷后，局部含有一種獨特的細胞群，體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)這種細胞表現(xiàn)出克隆形成能力、自我更新及多向分化潛能等干細胞的普遍特性，并表達干細胞表面抗原。我們將這一獨特的損傷后

8、肌腱來源的細胞群命名為損傷源性肌腱祖細胞。損傷源性肌腱祖細胞的發(fā)現(xiàn)為今后探索肌腱鈣化的發(fā)生機制及探索新的治療方式提供了細胞水平靶點。
　　第四章 以損傷源性肌腱祖細胞為治療靶點的藥物探索
　　目的:以損傷源性肌腱祖細胞為細胞水平靶點，探索潛在的可以抑制肌腱鈣化的藥物。
　　方法:將小鼠行安樂死后取其跟腱，將肌腱充分切碎，加入肌腱消化液，置于37℃水浴中震蕩消化1小時。將分離下來的細胞接種到100mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)后至P

9、3代。成骨及成軟骨培養(yǎng)體系下評價LDN-193189、RAR-γ agonist、GANT58及塞來昔布對損傷源性肌腱祖細胞成骨及成軟骨分化的影響。
　　結果:成軟骨培養(yǎng)體系中，LDN-193189、RAR-γ agonist、GANT58及塞來昔布均顯著降低阿爾新藍陽性染色濃度(Control:1.0455±0.0469; LDN-193189:0.2628±0.0411; RAR-γagonist:0.3461±0.0364;

10、 GANT58:0.5378±0.0402;塞來昔布:0.7117±0.0199）（均數(shù)±標準差）(F=338.262)(P＜0.0001)(n=4)。
　　結論:本研究以損傷源性肌腱祖細胞為細胞水平靶點，進行了大量藥物的嘗試，試圖發(fā)現(xiàn)潛在的可以抑制肌腱鈣化的藥物。本部分結果表明:LDN-193189、RAR-γ agonist、GANT58及塞來昔布均顯著抑制損傷源性肌腱祖細胞的成骨及成軟骨分化，從而提示上述四種藥物可能為抑制肌

11、腱鈣化的潛在藥物。
　　第五章 體內評價抑制肌腱鈣化的相關藥物
　　目的:采用跟腱切斷誘導的肌腱鈣化模型來評價相關藥物預防肌腱鈣化的有效性。
　　方法:采用C57小鼠，麻醉后在無菌條件下在右后跟處皮膚做一約1厘米的縱向切口，暴露肌膜及跟腱。在跟腱中段橫斷跖肌腱及跟腱，縫合皮膚。術后放回籠中自由活動。術后予LDN-193189、NRX204647、GANT58及塞來昔布預防肌腱鈣化。術后10周處死小鼠行小動物CT檢測鈣化

12、體積并于術后3周提取RNA評價藥物用于損傷肌腱的安全性。
　　結果:術后10周μCT結果顯示:LDN-193189(P＜0.0001)(n=5)、GANT58(P＜0.0001)(n=5)及Celecoxib(P＜0.0001)(n=5)均顯著降低肌腱鈣化的體積，RAR-γ agonist組肌腱鈣化體積與對照組相比差異不顯著(P=0.999)(n=5)（鈣化體積:Control:0.3763±0.1239 mm3;LDN-1931

13、89:0.0840±0.0095mm3;RAR-γ agonist:0.3856±0.1020mm3;GANT58:0.0250±0.0066 mm3;塞來昔布:0.0197±0.0122 mm3）（均數(shù)±標準差）。
　　結論:本部分研究通過肌腱切斷誘導的肌腱鈣化模型評價LDN-193189、NRX204647、GANT58及塞來昔布四種藥物在預防肌腱鈣化中的作用。我們的結果表明LDN-193189、GANT58及塞來昔布均可有效

14、抑制肌腱鈣化的發(fā)生。我們進一步比較各組肌腱相關基因表達，結果提示LDN-193189及GANT58可能影響肌腱的修復過程。因此，塞來昔布為抑制肌腱鈣化最為安全有效的藥物。
　　第六章 塞來昔布抑制肌腱鈣化的最佳治療時程
　　目的:本研究中我們將對塞來昔布抑制肌腱鈣化的最佳治療時程做一系統(tǒng)評估，探索保證其有效前提下的最短治療時程。
　　方法:采用C57小鼠，麻醉后在無菌條件下在右后跟處皮膚做一約1厘米的縱向切口，暴露肌膜

15、及跟腱。在跟腱中段橫斷跖肌腱及跟腱，縫合皮膚。術后放回籠中自由活動。術后予塞來昔布2周、6周及10周預防肌腱鈣化。術后10周處死小鼠行小動物CT檢測鈣化體積比較各組差異。
　　結果:術后10周μCT結果顯示:與對照組相比，Celecoxib0-6周組(P＜0.0001)(n=5)及Celecoxib0-10周組(P＜0.0001)(n=5)均顯著降低肌腱鈣化的體積，Celecoxib0-2周組(P=0.459)(n=5)肌腱鈣化體

16、積與對照組相比差異不具有統(tǒng)計學意義（鈣化體積:Control:0.3969±0.1209mm3; Celecoxib0-2:0.3279±0.1202 mm3; Celecoxib0-6:0.0149±0.0071 mm3; Celecoxib0-10:0.0197±0.0122 mm3)（均數(shù)±標準差）。
　　結論:本研究采用肌腱切斷誘導的肌腱鈣化模型，比較塞來昔布不同治療時程抑制肌腱鈣化的療效。結果表明:中長期塞來昔布給藥可有