糖基化終產(chǎn)物致血管鈣化的機制及其與冠狀動脈鈣化的相關(guān)性研究.pdf

1、背景和目的:血管鈣化是異位鈣化的主要表現(xiàn)，可產(chǎn)生嚴(yán)重病理后果。ACC/AHA2007年發(fā)表的臨床指南中，推薦冠脈鈣化積分作為動脈粥樣硬化和心肌梗死的預(yù)后指標(biāo)之一。糖尿病的主要死因是心血管并發(fā)癥。DCCT和UKPDS等研究已經(jīng)證明強化血糖控制只能降低微血管而非大血管并發(fā)癥。糖尿病病程長短及血糖控制水平與糖尿病心血管死亡率無關(guān)。蛋白質(zhì)非酶糖基化形成的糖基化終產(chǎn)物(advanced glycated end-products，AGEs)是糖尿

2、病血管并發(fā)癥的重要途徑之一，研究發(fā)現(xiàn)AGEs誘導(dǎo)VSMCs鈣化與血糖無關(guān)，且通過阻斷AGEs受體(receptor forAGEs, RAGE)可以抑制糖尿病血清誘導(dǎo)的VSMCs鈣化。因此，探討AGEs致血管鈣化的發(fā)生機制，尋找有效的治療措施具有重要的意義。H2O2等氧化產(chǎn)物促進(jìn)VSMCs成骨樣轉(zhuǎn)化，AGEs是否通過氧化應(yīng)激促進(jìn)血管鈣化需要進(jìn)一步研究。近年的研究發(fā)現(xiàn)血管鈣化是一個由細(xì)胞介導(dǎo)的主動調(diào)節(jié)的類似骨重構(gòu)的過程。血管平滑肌細(xì)胞(v

3、ascular smooth muscle cells，VSMCs)向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化是血管鈣化的主要機制。有研究表明動脈粥樣硬化鈣化斑塊處存在少量破骨樣細(xì)胞，破骨樣細(xì)胞可以使鈣化中膜彈力板去鈣化。提示病理情況下，血管鈣化存在成骨方面和破骨方面失平衡。我們猜想AGEs在促進(jìn)血管平滑肌成骨樣轉(zhuǎn)化的同時抑制單核/巨噬細(xì)胞向破骨樣轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)血管鈣化。本研究在離體水平觀察AGEs主要成分之一CML對單核/巨噬細(xì)胞破骨樣轉(zhuǎn)化的影響，并進(jìn)一步探討

4、可能的機制。許多臨床研究表明，糖基化終產(chǎn)物與冠狀動脈粥樣硬化程度相關(guān)，但與冠狀動鈣化之間的關(guān)系尚不明確。有研究表明皮膚AGEs特定熒光與1型糖尿病患者冠狀動脈鈣化（coronary artery calcification，CAC）嚴(yán)重程度正相關(guān)。血漿AGEs主要成分之一pentoside水平同透析患者CAC呈正相關(guān)。本研究探討CML/sRAGE及氧化應(yīng)激指標(biāo)8-OHdG與CAC的關(guān)系。
　　方法:1、運用AGE-BSA、RAGE

5、中和抗體分別或共同干預(yù)體外鈣化培養(yǎng)的大鼠主動脈VSMCs。3、采用小劑量鏈脲佐菌素結(jié)合高能量飼料制備2型糖尿病大鼠模型（DM組），維生素D3聯(lián)合尼古丁制備動脈鈣化大鼠模型（VDN組），糖尿病血管鈣化大鼠模型采用小劑量鏈脲佐菌素結(jié)合高能量飼料，同時肌肉注射維生素D3并尼古丁灌胃（DN+VDN組）。4、運用CML、RAGE中和抗體分別或共同干預(yù)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的人外周血單核細(xì)胞(hPBMCs)。5、收集患者外周靜脈血分離分裝后-80℃保存，檢測

6、生化指標(biāo)等。6、硝酸銀(Von Kossa)染色及甲o(hù)-酚酞絡(luò)合酮方法檢測鈣鹽沉積。5、磷酸苯二鈉（金氏）法測定ALP活性。7、實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測RAGE、Cathepsin K、TRAPmRNA表達(dá)。8、蛋白免疫印跡檢測RAGE、cu/zn SOD、Nox1、Cathepsin K、TRAP蛋白表達(dá)。9、酶聯(lián)免疫吸附(ELI SA)法檢測人外周血漿CML、sRAGE、8-OHdG。10、熒光分光光度法檢測實驗動物血清AG

7、Es濃度。11、免疫組織化學(xué)法檢測實驗動物胸主動脈RAGE蛋白表達(dá)。12、熒光法檢測細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子含量。13、采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，采用one-way ANOVA、Logistic回歸分析、x2檢驗等方法進(jìn)行顯著性檢驗，差異顯著性設(shè)定為P＜0.05。
　　結(jié)果:1、在體水平，DM+VDN組主動脈鈣含量、主動脈AGEs水平、MDA含量、ALP蛋白水平及RAGE蛋白表達(dá)明顯增加，Cu/Zn SOD活性明顯降低;在細(xì)胞

8、水平，AGEs促進(jìn)鈣化誘導(dǎo)培養(yǎng)的VSMCs RAGE蛋白、Nox1蛋白表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子水平明顯升高，而Cu/Zn SOD蛋白表達(dá)明顯降低，ALP活性及鈣含量明顯升高，而RAGE抗體及ROS抑制劑可以抑制這種效應(yīng)。2、CML呈濃度依賴性抑制單核細(xì)胞TRAP、Cathepsin K mRNA和蛋白表達(dá)，TRAP染色示CML抑制單核細(xì)胞破骨樣轉(zhuǎn)化，同時抑制NFAT1c的蛋白表達(dá)，RAGE抗體阻斷后CML的抑制效應(yīng)減弱。3、血漿CML水平

9、與重度CAC存在正相關(guān)，與CAC嚴(yán)重程度不相關(guān);血漿sRAGE水平不僅與重度CAC存在負(fù)相關(guān)，且與CAC嚴(yán)重程度負(fù)相關(guān);血漿8-OHdG水平與CAC存在及其嚴(yán)重程度均正相關(guān);血漿CML、sRAGE、8-OHdG水平三者協(xié)同預(yù)測重度鈣化存在并未表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。
　　結(jié)論:1、AGEs可能通過上調(diào)RAGE表達(dá)增加氧化應(yīng)激的途徑，促進(jìn)血管鈣化。2、AGEs主要抗原表位CML可通過RAGE/NFAT1c途徑抑制單核細(xì)胞破骨樣轉(zhuǎn)化。3、C