糖基化終產(chǎn)物在糖尿病血管鈣化中的作用及羅格列酮干預(yù)效應(yīng)的研究.pdf

1、背景和目的：以鈣鹽沉積及相關(guān)變化為特點(diǎn)而發(fā)生在骨骼的骨化、鈣化是人體內(nèi)常見的生理性過(guò)程。但異位的鈣化，如發(fā)生在軟組織和血管的鈣化，則可能產(chǎn)生重要病理后果。ACC/AHA2007年發(fā)表的臨床指南中，推薦冠脈鈣化積分作為動(dòng)脈粥樣硬化和心肌梗死的預(yù)后指標(biāo)之一。最近發(fā)現(xiàn)粥樣斑塊中細(xì)胞水平的微鈣化灶可能是易損斑塊破裂的重要原因。在臨床方面，血管鈣化與傳統(tǒng)心血管危險(xiǎn)因素，動(dòng)脈粥樣硬化性血管病變總體負(fù)擔(dān)密切相關(guān)。近年的研究發(fā)現(xiàn)血管鈣化與骨的形成過(guò)程有

2、關(guān)，是由細(xì)胞介導(dǎo)的主動(dòng)調(diào)節(jié)的過(guò)程。血管的管壁細(xì)胞尤其是血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)在誘導(dǎo)條件下(高磷、高鈣、炎癥因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β，25-羥化膽固醇和高低密度脂蛋白等)均可轉(zhuǎn)分化為成骨樣細(xì)胞，合成和分泌多種骨形成蛋白，在細(xì)胞外基質(zhì)或胞質(zhì)中形成鈣結(jié)節(jié)。
　　 糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)患者常見血管鈣化，表現(xiàn)為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中鈣化灶和血管中膜鈣化

3、并存，與病人的首位死亡原因一心血管終點(diǎn)事件密切相關(guān)。DCCT和UKPDS等研究已經(jīng)證明無(wú)論在1型還是2型糖尿病，強(qiáng)化血糖控制只能降低微血管而非大血管并發(fā)癥。因此，探討糖尿病血管鈣化的發(fā)生機(jī)制，尋找有效的治療措施具有重要的意義。近年來(lái)研究證實(shí)蛋白質(zhì)非酶糖基化形成的糖基化終產(chǎn)物(advanced glycated end-products，AGEs)通過(guò)受體(receptor forAGEs，RAGE)結(jié)合或非受體途徑影響胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、刺激

4、細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)釋放、促進(jìn)胞外基質(zhì)積聚等，在介導(dǎo)高血糖引致糖尿病慢性血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。而AGEs是否可能通過(guò)受體途徑促進(jìn)炎癥因子如腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-a,TNF-α)和白介素-6(interleukin-6，IL-6)等表達(dá)參與糖尿病血管鈣化發(fā)生的早期事件值得研究。
　　 PPARγ受體激活劑一噻唑烷二酮由于能增加胰島素敏感性已廣泛用于2型糖尿病的治療。研究證實(shí)噻唑

5、烷二酮(如羅格列酮(rosiglitazone，RSG)還具有獨(dú)立于降糖作用之外的心血管保護(hù)效應(yīng)，但有關(guān)噻唑烷二酮心血管保護(hù)作用的藥理機(jī)制尚未闡明。本研究從細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2個(gè)水平觀察AGE-BSA對(duì)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)，成骨細(xì)胞特異性結(jié)合因子(core binding factor a-1，Cbfα-1)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、TNF-α和IL-6的表達(dá)分泌以及鈣鹽沉積的影

6、響及其可能的機(jī)制;并探討羅格列酮對(duì)上述可能影響的干預(yù)效應(yīng)。為進(jìn)一步闡明血管鈣化發(fā)生的病理機(jī)制和噻唑烷二酮心血管保護(hù)作用的藥理機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法： l、運(yùn)用BSA和葡萄糖體外制備的糖基化修飾的牛血清白蛋白(AGE-bovine serumalbumin，AGE-BSA)。2、運(yùn)用AGE-BSA、anti-RAGE中和抗體和羅格列酮分別或共同干預(yù)體外鈣化培養(yǎng)的大鼠主動(dòng)脈VSMCs。3、采用小劑量鏈脲佐菌素結(jié)合高能量飼料制

7、備2型糖尿病大鼠模型(DM組)，維生素D3聯(lián)合尼古丁制備動(dòng)脈鈣化大鼠模型(VDN組)，糖尿病血管鈣化大鼠模型采用小劑量鏈脲佐菌素結(jié)合高能量飼料，同時(shí)肌肉注射維生素D3并尼吉丁灌胃(DN+VDN組)，并隨機(jī)分為未治療組、RSG治療組和格列本脲(glibenclamide，GLB)治療組。4、硝酸銀(Von Kossa)染色及甲o(hù)-酚酞絡(luò)合酮方法檢測(cè)鈣鹽沉積。5、磷酸苯二鈉(金氏)法測(cè)定ALP活性。6、實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)RAG

8、E、Cbfα-1、ALP、OPN及TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)。7、蛋白免疫印跡檢測(cè)RAGE、Cbfα-I及OPN蛋白表達(dá)。8、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞上清或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物血清TNF-α、IL-6。9、熒光分光光度法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清AGEs濃度。10、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胸主動(dòng)脈RAGE及OPN蛋白表達(dá)。11、數(shù)據(jù)以-x±S表示，SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，采用one-wayANOVA進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，差異顯著

9、性設(shè)定為P＜0.05。
　　 結(jié)果：1、與BSA組相比，AGE-BSA組VSMCs的RAGE、Cbfα-1、ALP、OPN、TNF-α及IL-6的表達(dá)，ALP活性，培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6含量，以及細(xì)胞內(nèi)鈣含量明顯增加(p<0.01～0.05)，且細(xì)胞內(nèi)鈣含量和ALP活性隨AGE-BSA濃度升高和干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)而增加;2、anti-RAGE中和抗體和RSG分別與AGE-BSA共孵育能抑制AGE-BSA的上述效應(yīng)，且RSG能抑

10、制AGE-BSA誘導(dǎo)的RAGE表達(dá)(p＜0.01～0.05)。3、DN+VDN組大鼠血清AGEs、TNF-α和IL-6水平，胸主動(dòng)脈RAGE、Cbfα-1、ALP、OPN及TNF-α、IL-6的表達(dá)及鈣含量明顯高于鈣化組(戶＜0.01～0.05)。4、RSG組血清AGEs TNF噸及IL-6水平低于未治療組和GLB組，(P＜0.05)；RSG組胸主動(dòng)脈RAGE、Cbfα-1、ALP及OPN表達(dá)及鈣含量均低于未治療組和GLB治療組但高于鈣

11、化組(P＜0.05)；與未治療組相比，GLB組上述指標(biāo)差異無(wú)顯著性。
　　 結(jié)論：1、AGEs可能通過(guò)RAGE途徑上調(diào)TNF-α、IL-6表達(dá)分泌，促進(jìn)VSMCs鈣化。2、糖尿病大鼠血清AGEs、TNF-α、IL-6水平升高，胸主動(dòng)脈RAGE、Cbfα-1、ALP和OPN表達(dá)及鈣鹽沉積增加。3、羅格列酮減少體內(nèi)AGEs積聚，下調(diào)RAGE表達(dá)，降低TNF-α、IL-6水平，抑制Cbfα-1、ALP和OPN表達(dá)，減輕糖尿病大鼠胸主動(dòng)