EphB2在B細(xì)胞活化中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 EphB2在B細(xì)胞上表達(dá)及其作用的初步研究
　　背景：EphB2是受體型酪氨酸激酶 Eph家族成員，主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移及內(nèi)皮細(xì)胞簇集。近年研究發(fā)現(xiàn)，EphB2在T細(xì)胞和單核細(xì)胞上也有表達(dá)，并且其前向信號(hào)可促進(jìn)T細(xì)胞遷移和單核細(xì)胞活化。然而，EphB2在B細(xì)胞上的表達(dá)及作用至今尚無(wú)明確報(bào)道。
　　方法：取健康志愿者靜脈血，分選出B淋巴細(xì)胞。分別利用LPS、anti-IgM和IL-

2、4刺激幼稚B細(xì)胞活化，以western blot檢測(cè)EphB2及其配體ephrinB1/B2蛋白表達(dá)情況。同時(shí)，通過(guò)轉(zhuǎn)染EphB2 siRNA以抑制EphB2表達(dá)，并設(shè)立陰性對(duì)照siRNA（NC）轉(zhuǎn)染組和非轉(zhuǎn)染對(duì)照組，檢測(cè)其對(duì)B細(xì)胞增殖、分泌細(xì)胞因子TNF-α及分泌IgG/IgM抗體水平的影響。
　　結(jié)果：EphB2及其特異性配體ephrinB1和ephrinB2在人外周血幼稚B細(xì)胞上均有表達(dá)，且體外刺激B細(xì)胞活化后，EphB2表

3、達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05），而ephrinB1和ephrinB2表達(dá)均無(wú)明顯變化。同時(shí)，轉(zhuǎn)染siRNA并檢測(cè)B細(xì)胞活化指標(biāo)，結(jié)果顯示，與NC轉(zhuǎn)染組和非轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，EphB2 siRNA轉(zhuǎn)染組B細(xì)胞增殖（P<0.05）、B細(xì)胞培養(yǎng)上清TNF-α（P<0.01）及IgG水平(P<0.05)均顯著下降，然而各組之間IgM水平無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論：EphB2及其配體ephrinB1/B2在人B細(xì)胞上有表達(dá)，且EphB2在B細(xì)胞活化中

4、起到重要的促進(jìn)作用。
　　第二部分調(diào)控B細(xì)胞EphB2表達(dá)的microRNA的篩選和鑒定
　　背景： microRNA是一種內(nèi)源性的、長(zhǎng)度約為20-24個(gè)核苷酸的小RNA，通過(guò)與 mRNA特異性結(jié)合使其降解或抑制其翻譯為蛋白質(zhì)，并因其穩(wěn)定性、保守性及靶向結(jié)合的特異性，成為疾病分子靶向治療方面的研究熱點(diǎn)。有研究顯示，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中，EphB2表達(dá)可受到多種microRNA的調(diào)控。因此，篩選出具有特異性調(diào)控 B

5、細(xì)胞 EphB2表達(dá)的 microRNA對(duì)進(jìn)一步研究EphB2在B細(xì)胞中的作用機(jī)制有重要價(jià)值。
　　方法：利用miRWalk數(shù)據(jù)庫(kù)并綜合參考5種生物信息學(xué)分析結(jié)果，預(yù)測(cè)可調(diào)控人EphB2表達(dá)的microRNAs，并利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)上述microRNAs在B細(xì)胞中的表達(dá)情況。之后，構(gòu)建含有EphB23’UTR結(jié)合位點(diǎn)的熒光霉素報(bào)告基因載體質(zhì)粒，并與miR-185模擬物或模擬物NC共轉(zhuǎn)染入工具細(xì)胞293T內(nèi)，檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光值

6、，以驗(yàn)證miR-185是否可與EphB2 mRNA特異性結(jié)合并影響EphB2表達(dá)。另外，通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-185模擬物和抑制劑進(jìn)入B細(xì)胞，并western檢測(cè)B細(xì)胞EphB2蛋白水平、流式檢測(cè)EphB2（+）B細(xì)胞百分比和平均熒光強(qiáng)度，以進(jìn)一步驗(yàn)證miR-185是否可影響B(tài)細(xì)胞上EphB2的表達(dá)；同時(shí)，檢測(cè)B細(xì)胞增殖、分泌細(xì)胞因子TNF-α及分泌IgG/IgM抗體水平，以探究miR-185對(duì)B細(xì)胞活化的影響。
　　結(jié)果：miRWal

7、k數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)出miRNA-185、miRNA-661、miRNA-593、miRNA-211、miRNA-515和miRNA-204這6種microRNA可調(diào)控人EphB2表達(dá)。上述6種microRNA在人外周血幼稚B細(xì)胞中均有表達(dá)，然而只有miRNA-185， miRNA-515和 miRNA-204在活化的 B細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)（ P<0.05），且與miRNA-515和miRNA-204相比，miRNA-185下調(diào)更為明顯（P<0.0

8、5）。熒光霉素報(bào)告基因結(jié)果顯示，含 EphB23’UTR野生型結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因與miRNA-185模擬物共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞熒光測(cè)值下降41％（P<0.01）。進(jìn)一步，我們分別轉(zhuǎn)染miR-185模擬物和抑制劑進(jìn)入B細(xì)胞，檢測(cè)到與NC組和非轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，miR-185模擬物轉(zhuǎn)染組中western檢測(cè)B細(xì)胞EphB2蛋白水平、流式檢測(cè)EphB2（+）B細(xì)胞百分比和平均熒光強(qiáng)度均明顯下調(diào)（P<0.05），miR-185抑制劑轉(zhuǎn)染組中western

9、檢測(cè)B細(xì)胞EphB2蛋白水平、流式檢測(cè)EphB2（+）B細(xì)胞百分比和平均熒光強(qiáng)度均明顯上調(diào)（P<0.05）；同時(shí)，我們檢測(cè)各組B細(xì)胞活化指標(biāo)，結(jié)果顯示，miR-185模擬物轉(zhuǎn)染組B細(xì)胞增殖（P<0.05）、B細(xì)胞培養(yǎng)上清TNF-α（P<0.01）及IgG水平(P<0.05)均顯著下降，miR-185抑制劑轉(zhuǎn)染組B細(xì)胞增殖（P<0.05）、B細(xì)胞培養(yǎng)上清TNF-α（P<0.01）及IgG水平(P<0.05)均顯著上升。
　　結(jié)論：m

10、iR-185可特異性抑制B細(xì)胞上EphB2表達(dá)，從而阻礙B細(xì)胞活化。
　　第三部分EphB2調(diào)控B細(xì)胞活化的分子機(jī)制
　　背景：細(xì)胞活化的核心轉(zhuǎn)錄因子為NF-kB，其亞基p65是B細(xì)胞活化中的重要信號(hào)分子。在神經(jīng)細(xì)胞中，Src為EphB2下游的重要信號(hào)分子，可促進(jìn)神經(jīng)突觸形成和重塑，且最近研究表明Src活化后可激活NF-kB(p65)分子。我們推測(cè)EphB2可能通過(guò) Src-p65信號(hào)通路調(diào)控 B細(xì)胞活化。另外，一種新近發(fā)現(xiàn)

11、的信號(hào)分子Notch1可參與T細(xì)胞活化，但其在B細(xì)胞活化中的作用尚不明確。此部分我們將探究上述信號(hào)分子在EphB2調(diào)控B細(xì)胞活化中的作用。
　　方法：通過(guò)轉(zhuǎn)染EphB2 siRNA或miR-185模擬物寡聚核苷酸以抑制B細(xì)胞EphB2表達(dá)，western blot分別檢測(cè)B細(xì)胞phospho-Src/總Src、phospho-p65/總p65及Notch1蛋白水平，以探究EphB2調(diào)控B細(xì)胞活化中可能激活的信號(hào)通路。
　　結(jié)

12、果：與對(duì)照組相比，EphB2 siRNA和miR-185模擬物轉(zhuǎn)染組B細(xì)胞磷酸化Src表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05），各組B細(xì)胞總Src表達(dá)無(wú)明顯差異；磷酸化p65表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05），各組B細(xì)胞總p65表達(dá)無(wú)明顯差異。同時(shí)，EphB2 siRNA和miR-185模擬物轉(zhuǎn)染組B細(xì)胞中Notch1的表達(dá)受到顯著抑制（P<0.05）。
　　結(jié)論：EphB2可能通過(guò)Src-p65信號(hào)通路調(diào)控B細(xì)胞活化，Notch1也在其中發(fā)揮重要