結(jié)直腸癌中EphB2的表達(dá)及其下調(diào)機制研究.pdf

1、EPHB2基因編碼的蛋白EphB2是受體酪氨酸激酶家族的一員，表達(dá)于細(xì)胞膜，與相鄰細(xì)胞表面的配體結(jié)合介導(dǎo)雙向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在膜蛋白酶水解作用或內(nèi)吞作用下受體、配體之間的結(jié)合被破壞，從而導(dǎo)致細(xì)胞間的排斥。早期研究發(fā)現(xiàn)EphB2在人類多數(shù)腫瘤(包括結(jié)直腸癌)中存在表達(dá)上調(diào)，能通過提升細(xì)胞遷移能力和促進血管生成，參與腫瘤的形成和發(fā)展。但新近研究卻發(fā)現(xiàn)EphB2在結(jié)直腸腺瘤-癌過渡時期存在不同程度的表達(dá)下調(diào)，它與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，主要通

2、過與其配體結(jié)合介導(dǎo)細(xì)胞間排斥(區(qū)室化)抑制結(jié)直腸上皮細(xì)胞癌變及進展。 結(jié)直腸癌中EphB2表達(dá)下調(diào)的原因還不清楚。目前，僅發(fā)現(xiàn)極少數(shù)結(jié)直腸癌中存在EPHB2基因的突變、雜合性丟失等遺傳學(xué)改變。而關(guān)于表觀遺傳學(xué)改變也存在一定爭議。因此有必要對結(jié)直腸癌中EphB2的表達(dá)和調(diào)控進行進一步的研究。 在本研究中，我們采用Western印跡法檢測了4株結(jié)腸癌細(xì)胞EphB2的表達(dá)，采用免疫組織化學(xué)和Real-timePCR技術(shù)檢測了1

3、3例正常人直腸粘膜組織、30例結(jié)直腸癌及癌旁正常腸粘膜組織中EphB2蛋白和mRNA表達(dá)水平，證實結(jié)直腸癌中EphB2的表達(dá)存在不同程度的下調(diào)，其表達(dá)水平與腫瘤分化程度有關(guān)(P＜0.05)，分化越差，表達(dá)越低。采用甲基化特異性PCR技術(shù)檢測了上述細(xì)胞和標(biāo)本中EPHB2基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無一例存在甲基化。同時采用亞硫酸氫鹽修飾后基因組測序技術(shù)在所有細(xì)胞和其中17例EphB2缺失表達(dá)的結(jié)直腸癌組織中驗證了以上結(jié)果。

4、 由于轉(zhuǎn)錄調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)節(jié)的重要環(huán)節(jié)，目前關(guān)于EPHB2這方面的研究報道較少。我們首先采用報告基因和熒光素酶檢測系統(tǒng)對EPHB2基因啟動子進行克隆、鑒定，確定核心啟動子位于-425～+83區(qū)域內(nèi)，并發(fā)現(xiàn)-1174～970區(qū)域存在沉默子。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)這兩個區(qū)域分別存在轉(zhuǎn)錄因子Spl的結(jié)合位點之一GC盒和轉(zhuǎn)錄因子c-Rel的結(jié)合位點。我們對這兩個位點進行突變后發(fā)現(xiàn)，GC盒突變后啟動子活性較突變前降低了15％左右(P＞0.05)；

5、c-Rel結(jié)合位點突變后啟動子活性較突變前升高了85％左右(P＜0.01)。 綜上所述，結(jié)直腸癌中EphB2的表達(dá)無論在蛋白還是mRNA水平均存在不同程度的下調(diào)，其原因與基因啟動子區(qū)CpG島甲基化無關(guān)，而與轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。在結(jié)直腸癌中，可能是轉(zhuǎn)錄因子c-Rel活化后與沉默子結(jié)合，從而抑制了EPHB2基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。以上的研究結(jié)果為闡明結(jié)直腸癌中EphB2表達(dá)下調(diào)機制提供了新的線索，也有希望為結(jié)直腸癌的基因和藥物治療提供新的靶點。