中國(guó)柑橘黑斑病相關(guān)的葉點(diǎn)霉屬真菌種類、遺傳多樣性和快速診斷技術(shù)研究.pdf

1、柑橘黑斑病(Citrus Black Spot，CBS)，也稱黑星病，病原的有性態(tài)為柑橘球座菌(Guignardia citricarpa Kiely)，屬子囊菌門，座囊菌目;無(wú)性態(tài)為柑橘葉點(diǎn)霉菌(Phyllosticta citricarpa(McAlpine) van der Aa)，屬半知菌類，腔孢綱，球殼孢目。病菌主要危害果實(shí)，在果皮上形成病斑導(dǎo)致鮮果的商品性下降，甚至無(wú)法上市鮮售。CBS病菌被歐盟列為A1類嚴(yán)禁入境的有害生物，

2、也是美國(guó)嚴(yán)禁入境的有害生物，因此是包括我國(guó)在內(nèi)有黑斑病發(fā)生國(guó)家柑橘鮮果出口的重要障礙。盡管我國(guó)是柑橘的原產(chǎn)地之一，栽培柑橘種類繁多，黑斑病發(fā)生普遍，但對(duì)不同類型柑橘的黑斑病菌病原種類是否一致，以及病菌的生物學(xué)特性和分子變異并無(wú)研究。
　　 本研究從我國(guó)柑橘主產(chǎn)區(qū)幾大栽培柑橘上收集黑斑病或疑似黑斑病癥狀的果實(shí)和葉片，分離培養(yǎng)獲得代表性菌株若干，在此基礎(chǔ)上開展這些代表性菌株的種類鑒定、種內(nèi)遺傳多樣性分析，以及種特異性引物的篩選和相關(guān)

3、的PCR鑒定體系的建立。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.建立了P.citriasiana的分子鑒定技術(shù)在ITS1區(qū)域設(shè)計(jì)了針對(duì)于亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌P.citriasiana的特異性上游引物Pca8，結(jié)合下游引物ITS4，建立了準(zhǔn)確、靈敏和快速鑒定P.citriasiana的PCR體系。利用該體系可從P.citriasiana菌株中擴(kuò)增出488 bp的特異性條帶，而不能從柑橘葉點(diǎn)霉菌P.citricarpa和首都葉點(diǎn)霉菌P.capit

4、alensis(一種內(nèi)生菌)，以及其他柑橘常發(fā)病害病原菌中擴(kuò)增出條帶。該體系檢測(cè)P.citriasiana DNA最低為12 pg，整個(gè)過(guò)程可在3小時(shí)內(nèi)完成。
　　 2.明確了中國(guó)柑橘上葉點(diǎn)霉屬真菌種類自2007-2011年，從我國(guó)10個(gè)省市的寬皮橘(Citrus reticulata)、柚(C.maxima)、葡萄柚(C paradisi)、甜橙(C.sinensis)以及檸檬(C.limon)等具典型或非典型黑斑病癥狀的果實(shí)

5、和葉片上分離獲得496個(gè)Phyllosticta菌株。通過(guò)形態(tài)學(xué)比較，可將這些菌株分為4類。選擇74個(gè)代表性菌株，克隆測(cè)定其18S rDNA和28S rDNA的部分區(qū)域、核糖體DNA的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)及其中的5.8S亞基(internal transcribed spacer，ITS)、肌動(dòng)蛋白(Actin，ACT)，延長(zhǎng)因子(translation elongation factor-1 alpha，TEF1)，B微管蛋白(B-tubu

6、lin，Tub)和鈣調(diào)蛋白(calmodulin，Cal)基因的部分序列，單獨(dú)或合并后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這74個(gè)菌株分為4個(gè)明顯的分支。其一為P.citricarpa，即被歐盟和美國(guó)列為檢疫對(duì)象的柑橘葉點(diǎn)霉菌。該病菌的寄主有寬皮橘、甜橙和檸檬，但沒(méi)有從柚上發(fā)現(xiàn);其二為P.citriasiana，引起柚黑斑?。ㄒ脖环Q為棕褐斑病，“tan spot”），寄主為沙田柚和琯溪蜜柚，但未從其他柑橘種上發(fā)現(xiàn);其三是P.capitalensis

7、，即一種內(nèi)生菌，可從本研究中的各種柑橘的有癥或無(wú)癥材料上獲得;其四是一個(gè)有別于已有的Phyllosticta spp.，本文暫時(shí)將之定為Phyllostictacitrichinaensis X.H.Wang，K.D.Hyde&H.Y.Li。該菌可從本研究中的各種柑橘的非典型黑斑病癥狀的材料上獲得。
　　 在這4個(gè)Phyllosticta spp.中，P.citrichinaensis的分生孢子最小，附屬絲最長(zhǎng)，短桿狀孢子和子囊

8、孢子最大;P.citrichinaensis在PDA，CMA和MEA培養(yǎng)基表面形成具有多個(gè)環(huán)形凹槽的菌落，在OA培養(yǎng)基上不產(chǎn)生黃色素;當(dāng)以葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、甘露醇、山梨醇、麥芽糖分別作為唯一碳源時(shí)，P.citrichinaensis生長(zhǎng)較差，菌落直徑小于其他三種Phyllosticta;當(dāng)以尿素、酒石酸銨、天門冬氨酸、乙酸銨、(NH4)2SO4、NH4NO3、NaNO3、胰蛋白胨、脯氨酸、甘氨酸分別作為唯一氮源時(shí)，P.citr

9、ichinaensis生長(zhǎng)最差，菌落直徑均小于其他三個(gè)Phyllosticta種，且P.citrichinaensis幾乎不能利用尿素、酒石酸銨、天門冬氨酸、乙酸銨、(NH4)2SO4、 NH4NO3;P.citrichinaensis生長(zhǎng)pH范圍為3.0-6.0，最適為4.0，其次為3.0。在pH為3.0-5.0的PDA培養(yǎng)基上，P.citrichinaensis比P.citriasiana和P.citricarpa生長(zhǎng)快，但比P.c

10、apitalensis生長(zhǎng)慢。
　　 3.建立巢式多重PCR鑒定柑橘上四種葉點(diǎn)霉屬真菌的技術(shù)體系比較4種葉點(diǎn)霉屬真菌的ITS1及18S區(qū)域序列，設(shè)計(jì)并篩選了針對(duì)P.citrichinaensis、P.citricarpa、P.capitalensis和P.citriasiana特異性上游引物Pcc1、Pc1、Pct4和Pca8(見(jiàn)1)，并均以通用引物ITS4作為下游引物。以已知該4種菌的菌株DNA作為對(duì)照，首先使用ITS4/IT

11、S5對(duì)供試菌株進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物稀釋50-100倍后，同時(shí)加入引物對(duì)Pcc1/ITS4、Pc1/ITS4、Pct4/ITS4和Pca8/ITS4，在退火溫度為60℃條件下進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，通過(guò)擴(kuò)增條帶與已知種菌株的相應(yīng)擴(kuò)增條帶大小的比較，確定待測(cè)樣品所屬的葉點(diǎn)霉屬菌的種類。該體系的靈敏度達(dá)到2 ag的DNA。與傳統(tǒng)PCR相比其靈敏度至少提高106倍。不僅可用于試驗(yàn)室培養(yǎng)的待測(cè)菌株的鑒定，還可以用于果實(shí)疑似黑斑病的病斑快速鑒定

12、。
　　 4.明確了中國(guó)柑橘葉點(diǎn)霉屬真菌遺傳多樣性通過(guò)對(duì)影響PCR反應(yīng)的主要成分模板DNA、Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶及引物等條件的優(yōu)化，建立了適合柑橘葉點(diǎn)霉菌的ISSR-PCR反應(yīng)體系。利用該體系從100條引物中篩選出11條擴(kuò)增條帶穩(wěn)定、清晰、重復(fù)性好和多態(tài)性高的引物。利用篩選的11條引物和優(yōu)化的ISSR-PCR體系，對(duì)供試的110個(gè)來(lái)自柑橘的葉點(diǎn)霉屬菌株進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出197個(gè)條帶，多態(tài)性條帶為194個(gè)，多態(tài)

13、率為98.5％，證明中國(guó)柑橘上葉點(diǎn)霉屬真菌遺傳多樣性豐富。利用NTSYS-pc2.10軟件對(duì)擴(kuò)增的條帶進(jìn)行分析并構(gòu)建UPGMA聚類圖，顯示中國(guó)柑橘葉點(diǎn)霉屬真菌可以分為四個(gè)分支，每分支對(duì)應(yīng)著P.citricarpa，P.citriasiana，P.capitalensis和P.citrichinaensis。P.citricarpa的遺傳分化與寄主種類相關(guān)，而與地理來(lái)源無(wú)關(guān)。來(lái)自甜橙和檸檬的菌株與來(lái)自寬皮柑橘的菌株分布在不同的分支中，而來(lái)