棉花黑斑病相關(guān)基因的克隆及其早期診斷的探究.pdf

1、棉花輪紋菌(Alternaria macrospora)是棉花黑斑病的病原體，該病多發(fā)于苗期，在棉葉上產(chǎn)生黑斑，致使其脫落。病原體分泌的多聚半乳糖醛酸酶能夠降解組成植物細(xì)胞壁的果膠多糖，打開抵御入侵的第一道屏障，因此在侵染植物初期起著重要的作用。植物的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白在植物的抵抗疾病機(jī)制中作用顯著，能夠高效、專一的結(jié)合病源體侵染時(shí)分泌的多聚半乳糖醛酸酶，抑制其活性。因此，對(duì)編碼這兩種生物大分子的基因研究有利于揭示植物抵抗真菌機(jī)制

2、。此外，對(duì)于棉花黑斑病的早期檢測(cè)方面目前尚無報(bào)道。本文克隆了棉花輪紋菌多聚半乳糖醛酸酶基因(ampg)以及棉花多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因(Ghpgipl)，并以Ghpgipl基因?yàn)椤疤结槨?，在棉花黑斑病早期診斷領(lǐng)域做了探索性研究，并以葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)輔助、對(duì)比這一探究。研究取得了下列幾方面的主要結(jié)果和結(jié)論： 利用引物設(shè)計(jì)技巧設(shè)計(jì)一對(duì)引物，克隆了棉花輪紋菌的一個(gè)編碼多聚半乳糖醛酸酶基因，開放閱讀框大小為1242bp，命名為ampg

3、。序列比對(duì)結(jié)果表明它的核甘酸序列與同屬中的另外兩真菌Alternaria alternata和Alternaria citri的同源性非常高(分別為98.4％和98.3％)，而它們編碼的蛋白質(zhì)序列同源性卻只有76％，且ampg沒有內(nèi)含子。蛋白質(zhì)序列分析結(jié)果顯示ampg編碼的蛋白AMPG比上面兩種真菌對(duì)應(yīng)蛋白多出27個(gè)左右氨基酸殘基，并且有一段位于酶的活性位點(diǎn)(H-x-x-S-x-x-S)處，使其結(jié)構(gòu)更松散，可能導(dǎo)致酶的活性降低。這一結(jié)論

4、為Alternaria真菌家族進(jìn)化研究提供參考依據(jù)。對(duì)AMPG二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：它屬于糖基水解酶28家族，擁有兩個(gè)多聚半乳糖醛酸酶特有的PbH1域，一個(gè)預(yù)測(cè)的N-糖基化位點(diǎn)，五個(gè)預(yù)測(cè)的O-糖基化位點(diǎn)。 克隆了棉花(Gossypium hirsutum)的一段長(zhǎng)993bp pgip基因，命名為Ghpgipl，能夠編碼一段長(zhǎng)330氨基酸殘基，分子量與等電點(diǎn)分別為37.0 KDa與8.30的蛋白質(zhì)。Ghpgipl核酸序列與其他9種

5、物種的同源性為65.6％到70.3％，對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)序列為63.4％到68.6％。其編碼的蛋白GhPGIPl有10個(gè)N端、C端半胱氨酸殘基，6個(gè)可能的N糖基化位點(diǎn)和5個(gè)保守的亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域(LRR)。在所有的保守LRR域中，L是高度保守的。半定量RT-PCR試驗(yàn)結(jié)果顯示Ghpgipl在棉花的根、莖、葉中均表達(dá)，其中以葉中表達(dá)量最多，根和莖中相似。 棉花黑斑病是棉花苗期危害最深的三大病害之一，關(guān)于它的早期診斷目前國內(nèi)外還沒有見過報(bào)

6、道，本文利用基于棉花“防御基因”--多聚半乳糖醛酸抑制蛋白基因表達(dá)的半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，進(jìn)行了棉花黑斑病早期診斷的探究，并用Sigmascan Pro專業(yè)圖像處理軟件將所得的圖像信息轉(zhuǎn)化為更客觀、更有說服力的數(shù)字信息。結(jié)果顯示：棉花感染黑斑病后1-5天內(nèi)，該“防御基因”表達(dá)雖略有波動(dòng)，但變化不顯著，第5天為一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，之后它的表達(dá)量急劇下降。用葉綠素?zé)晒鈨x檢測(cè)感染株與健康株，也得到相類似的結(jié)果。葉綠素?zé)晒鈹?shù)據(jù)顯示：光合作用系統(tǒng)P