棉花黃萎病、枯萎病拮抗細(xì)菌的篩選及相關(guān)抗病基因的克隆.pdf

1、棉花黃萎病、枯萎病是目前最主要的真菌病害之一,給世界棉花產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,且極難防治.因此篩選拮抗菌、克隆抗病相關(guān)基因、研制高效生物農(nóng)藥具有十分重要的意義.本實(shí)驗(yàn)從士壤中篩選高效拮抗菌株,克隆細(xì)菌源棉花黃萎病、枯萎病的抗病相關(guān)基因,為構(gòu)建基因工程拮抗菌、制備微生物農(nóng)藥提供技術(shù)平臺(tái). 從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所黃萎病、枯萎病發(fā)病較輕的試驗(yàn)棉田采集根圍土,利用十壤稀釋分離法從中分離出21株細(xì)菌.通過平板對(duì)峙法,篩選出5株具有自主知

2、識(shí)產(chǎn)權(quán)的,對(duì)棉花黃萎病菌、枯萎病菌皆具有拮抗活性的細(xì)菌.這5株拮抗細(xì)菌C5,C6,S6,S1,B1的發(fā)酵液對(duì)黃萎病菌的抑菌效率分別達(dá)到22.6﹪,38.7﹪,53.1﹪,52.4﹪,21﹪;對(duì)枯萎病菌的抑菌效率分別達(dá)到22.8﹪,38.7﹪,55.2﹪,56﹪,23.5﹪.S6,S1的拮抗活性比較高,具有作為生防菌應(yīng)用的潛能. 5株拮抗細(xì)菌經(jīng)過革蘭氏染色均為陽(yáng)性細(xì)菌.利用16s rDNA技術(shù),s6被初步鑒定為芽孢桿菌.經(jīng)過在不同

3、培養(yǎng)條件下對(duì)S6 OD<,600>值的測(cè)定發(fā)現(xiàn):s6生長(zhǎng)迅速,28℃在LB液體培養(yǎng)基中2h即達(dá)到生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期,30h后達(dá)到生長(zhǎng)最高峰.S6在15～50℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng),最適生長(zhǎng)溫度為28℃.在pH值4～9之間均能良好生長(zhǎng),最適pH值為7. S6在Amp、Cm、Ery、Rif、Km等常見抗生素培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng),能耐受25μg/mL濃度的Spc、Sm.用細(xì)胞壁降解酶平板檢測(cè),發(fā)現(xiàn)S6在果膠酶、幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、葡聚糖酶檢測(cè)培養(yǎng)基平板上均出現(xiàn)

4、顯著水解圈.用 DNS等方法測(cè)定,S6分泌的幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、果膠酶、纖維素酶的活性分別達(dá)到6.04U,24.86U,23.37U,10.37U.同時(shí)發(fā)現(xiàn),S6能向胞外分泌一些揮發(fā)性的拮抗物質(zhì). 葡聚糖酶是重要的一類抗菌酶,具有很高的應(yīng)用價(jià)值.根據(jù)已知的葡聚糖酶基因序列設(shè)計(jì)葡聚糖酶特異引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得-700bp的條帶,經(jīng)測(cè)序及上網(wǎng)比對(duì),該序列與來源于Bacillus cereus E33L葡聚糖酶基因具有很高的相似性,

5、初步認(rèn)為該片段為葡聚糖酶的部分基因片段.為了進(jìn)一步獲得拮抗相關(guān)基因,利用轉(zhuǎn)座子pIC333構(gòu)建s6的插入突變體庫(kù),通過影印培養(yǎng),篩選出3株抗菌活性顯著下降的突變株,經(jīng)過BOX-PCR驗(yàn)證后,從突變株中獲得-500bp的序列,將此序列與GenBank中的序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)該片段與來源于枯草芽孢桿菌的伊枯草桿菌素合成酶 B (iturin A synthetase B)基岡片段相似性高達(dá)99﹪,初步認(rèn)為該序列為伊枯草桿菌素合成酶B基因片段.