李屬壞死環(huán)斑病毒遺傳多樣性分析和致病相關(guān)基因鑒定.pdf

1、李屬壞死環(huán)斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus，PNRSV)是一種在世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生的病毒病原物，能夠侵染危害多種核果類果樹（如桃、櫻桃、李、杏和油桃）和一些觀賞植物（如玫瑰和百合）。盡管PNRSV的形態(tài)學(xué)及群體遺傳結(jié)構(gòu)等特征已有較深入的研究，但有關(guān)PNRSV中國和加拿大分離物的遺傳多樣性的研究卻很少。因此本課題從系統(tǒng)研究PNRSV中國和加拿大分離物遺傳多樣性入手，建立了integrated-PCR用于

2、鑒定區(qū)分PNRSV不同組群（或基因型）分離物。在此基礎(chǔ)上，克隆測序兩個(gè)PNRSV分離物Chr3和Pch12的基因組序列全長并成功構(gòu)建了Chr3和Peh12侵染性cDNAs克隆。最后，對PNRSV的致病機(jī)理進(jìn)行研究，并鑒定出PNRSV的致病因子。結(jié)果如下:
　　 1.采用RT-PCR對我國多種李屬植物樣品進(jìn)行PNRSV檢測，發(fā)現(xiàn)PNRSV的侵染率為31.3％。并克隆了10個(gè)PNRSV中國分離物的CP基因序列，序列分析表明其核苷酸和

3、氨基酸序列的同源性分別為88.4～100％和89.8～100％。序列多重比對和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析表明:17個(gè)PNRSV中國分離物（包括NCBI數(shù)據(jù)庫已登錄的7個(gè)）歸屬于PV96，PV32和PE5組群，分布頻率依次為29.4％，58.8％和11.8％。最后，根據(jù)不同組群分離物CP基因核苷酸序列特征，建立了integreted-PCR用于鑒定區(qū)分不同PNRSV組群分離物。
　　 2.2010年10月-2011年6月，從加拿大安大略省N

4、iagara Fruit Belt一農(nóng)場采集69份核果類果樹枝條或葉片樣品(32份櫻桃和37份桃樹)，采用DAS-ELISA和RT-PCR進(jìn)行PNRSV檢測。檢測結(jié)果表明:18份桃樹和13份櫻桃樣品感染PNRSV，感染率為44.9％，且PNRSV陽性和陰性果樹樣品無明顯癥狀差異。并克隆測序了此31個(gè)分離物的基因組RNA3序列（包括5'端MP基因和3'端CP基因）?；贛P或CP基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析結(jié)果表明:此31個(gè)PNRSV分離物歸屬

5、于PV96和PV32兩大組群，其中以PV96為優(yōu)勢組群。據(jù)我們所知，本研究系首次在加拿大發(fā)現(xiàn)并鑒定PNRSV。
　　 3.采集Chr3和Pch12感染的枝條樣品，從其韌皮部組織提取總RNA。以隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈eDNA，后分別用引物RNAs-R/RNA1-L，RNAs-R/RNA2-L和RNAs-R/RNA3-L進(jìn)行PCR擴(kuò)增（其中RNAs-R為簡并引物，根據(jù)PNRSV基因組RNA1，RNA2和RNA3的3'-UTR保守區(qū)

6、序列設(shè)計(jì);RNA1-L，RNA2-L和RNA3-L為特異性引物，分別根據(jù)RNA1，RNA2和RNA3的5'-UTR特異序列設(shè)計(jì)）。擴(kuò)增產(chǎn)物回收、克隆和測序后，獲得近基因組RNA1，RNA2和RNA3全長序列?；蚪M5，端序列克隆采用5'-RACE試劑盒進(jìn)行;3'端序列克隆采用3'-RACE試劑盒進(jìn)行。序列組裝，獲得PNRSV分離物Chr3和Pch12的基因組全長序列(GenBank數(shù)據(jù)庫收錄號為:JN416771～JN416776)，并

7、分析基因組的結(jié)構(gòu)及特征。
　　 4.將PNRSV基因組RNA1，RNA2和RNA3的全長eDNA分別克隆到雙元植物表達(dá)載體pCass4-Rz的35S啟動(dòng)子和核酶(Rz)序列之間。農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)轉(zhuǎn)染PNRSV草本寄主黃瓜(Straight Eight)。DAS-ELISA和RT-PCR檢測結(jié)果表明:所有接種Chr3和Pch12克隆的黃瓜植株均感染PNRSV。感染Chr3黃瓜植株表現(xiàn)輕微黃化和壞死等癥狀，而感染Pch12黃瓜

8、植株表現(xiàn)嚴(yán)重環(huán)斑、壞死和矮縮等癥狀。
　　 為明確所構(gòu)建的Chr3和Pch12的cDNAs克隆能否感染其自然寄主，基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)染PNRSV自然寄主桃樹(GF305&Loring)和櫻桃(Bing)。DAS-ELISA和RT-PCR檢測結(jié)果表明:所有接種Chr3和Pch12的櫻桃植株均感染PNRSV。感染Pch12的櫻桃植株表現(xiàn)矮化、壞死和葉芽壞死等嚴(yán)重癥狀，而感染Chr3的櫻桃植株表現(xiàn)輕微癥狀-不規(guī)則形狀壞死斑和輕微矮化。約1/

9、4接種Pch12的桃樹(GF305)感染PNRSV，感病植株呈現(xiàn)褪綠環(huán)斑等癥狀，后迅速壞死并脫落形成“穿孔”;約1/3接種的桃樹(Loring)呈現(xiàn)輕微花葉癥狀（隨著植物生長，花葉癥狀逐漸消失）。然而，接種Chr3的桃樹(GF305&Loring)均未感染PNRSV?？傊?，本研究所構(gòu)建的Chr3和Pch12的cDNAs克隆能成功侵染其草本寄主及相應(yīng)自然寄主，并呈現(xiàn)不同致病性特點(diǎn)，即Pch12的致病性強(qiáng)于Chr3。
　　 5.為揭

10、示Pch12和Chr3致病性差異的分子機(jī)理，我們通過互換Chr3和Peh12的基因組RNA1，RNA2或RNA3以及基因組不同區(qū)段，獲得一系列雜合PNRSV病毒，致病性測定表明:RNA1的1C和RNA2的2M區(qū)段共同決定PNRSV致病性。以Pch12的侵染性cDNA克隆為背景，我們構(gòu)建了7個(gè)源于1C和2M區(qū)段的單/雙氨基酸替換的突變體，致病性測定結(jié)果表明:當(dāng)2M區(qū)段的Lys279突變?yōu)锳sn279，分離物Pch12致病性由強(qiáng)變?nèi)?1C區(qū)