晚期氧化蛋白產(chǎn)物誘導(dǎo)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化的機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是全球范圍內(nèi)引起終末期腎病的首要原因。蛋白尿是DN的主要臨床特征，也是促進(jìn)DN進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可由腎小球?yàn)V過(guò)屏障損害所致。腎小球內(nèi)皮細(xì)胞是腎小球?yàn)V過(guò)屏障的重要組成部分，在調(diào)節(jié)腎小球?yàn)V過(guò)率中發(fā)揮著重要的作用。腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷可導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)功能的功能失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生。此外，近年來(lái)，越來(lái)越多研究提示腎小球內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)可促DN的進(jìn)展。值得注意的是，內(nèi)皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)

2、分化(endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT/EndoMT)，本質(zhì)上可視為上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的一種特殊類(lèi)型，在內(nèi)皮細(xì)胞損傷過(guò)程及腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，而腎臟纖維化是DN的主要病理特征。EndMT發(fā)生時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞失去其特異性標(biāo)志物，如血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1/CD31(plat

3、eletendothelial cell adhesion molecule/cluster of differentiation31,PECAM-1/CD31)、血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)、claudin5等，而重新獲得間充質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物，如成纖維細(xì)胞特異性蛋白-1（fibroblast specific protein-1，F(xiàn)SP-1）、波形蛋白(v

4、imentin)、和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)等。EndMT這個(gè)概念最先出現(xiàn)在胚胎心臟發(fā)育中，但近年來(lái)越來(lái)越多的研究顯示EndMT在多種腎臟疾病中的腎纖維化過(guò)程中起著重要的作用。Zeisberg等學(xué)者利用三種不同的小鼠腎病模型（包括鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病腎病模型），最先報(bào)道腎臟纖維化中肌成纖維細(xì)胞細(xì)胞可能來(lái)源于EndMT，而肌成纖維細(xì)胞在腎臟纖維化中發(fā)揮重要作用。隨后，Li等學(xué)者研究證明

5、了EndMT可促進(jìn)早期DN的腎臟纖維化的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程。綜上，EndMT可促進(jìn)DN腎臟纖維化的進(jìn)展。因此，探討誘導(dǎo)EndMT發(fā)生的機(jī)制可能為DN的防治提供新的干預(yù)靶點(diǎn)。然而，目前關(guān)于EndMT發(fā)生的機(jī)制仍知之甚少。
　　多種因素可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷。最近研究提示，晚期氧化蛋白產(chǎn)物(advancedoxidation protein products，AOPPs)可通過(guò)激活晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptorof advanced

6、glycation end products，RAGE)介導(dǎo)的信號(hào)通路激活血管內(nèi)皮細(xì)胞。AOPPs是由Witko-Sarsat等學(xué)者于1996年首次在慢性腎衰患者血漿中發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)尿毒癥毒素，其主要成分是血清白蛋白酪氨酸殘基氧化后形成的蛋白交聯(lián)產(chǎn)物。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究證據(jù)表明AOPPs參與了多種腎臟疾病(包括DN)的發(fā)生發(fā)展的過(guò)程。我們課題組最近的研究也證明了AOPPs可誘導(dǎo)人近端腎小管上皮細(xì)胞肥大及發(fā)生EMT。但是，AOPPs是否可

7、誘導(dǎo)EndMT的發(fā)生及其機(jī)制目前尚待闡明。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(endoplasmic reticulum stress，ERS)在腎臟病理生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是由多種因素（如:饑餓、缺氧、病毒感染等）引起的病理生理狀態(tài)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而引起未折疊蛋白反應(yīng)（一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的適應(yīng)性過(guò)程）。然而，由過(guò)強(qiáng)或持久的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的未折疊蛋白反應(yīng)也可誘發(fā)細(xì)胞凋亡途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可誘導(dǎo)肺上皮細(xì)

8、胞、甲狀腺上皮細(xì)胞、及腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。值得注意的是，研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可導(dǎo)致腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷。但是，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在AOPPs誘導(dǎo)的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷過(guò)程中的作用尚未明確。
　　目的：本研究以體外培養(yǎng)的人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞(human renal glomerular endothelialcells，HRGECs)為研究對(duì)象，首先，探討AOPPs是否可誘導(dǎo)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞EndMT的發(fā)生，然后，探討AOPPs是否可誘導(dǎo)人腎小

9、球內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，最后，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否介導(dǎo)了AOPPs誘導(dǎo)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞EndMT的過(guò)程。
　　方法：
　　1.無(wú)內(nèi)毒素AOPPs修飾蛋白的制備和鑒定
　　參考文獻(xiàn)方法體外制備AOPPs-BSA。將經(jīng)純化后、無(wú)內(nèi)毒素的100 mg/mLBSA與200 mmol/L次氧酸等體積混合后（不含碳水化合物、游離脂肪酸和脂質(zhì)，以排除形成AGEs樣結(jié)構(gòu)），于室溫放置30分鐘后，即可制備出BSA與次氯酸摩爾比為1:1

10、40的AOPPs-BSA。制各的AOPPs-BSA在無(wú)菌PBS中透析24小時(shí)以去除游離的次氯酸。將100 mg/mL BSA與PBS等體積混合，作為對(duì)照。制備的AOPPs和BSA對(duì)照均需要經(jīng)過(guò)Detoxi-Gel凝膠柱去除內(nèi)毒素。所有制備的AOPPs-BSA和未經(jīng)過(guò)修飾的BSA經(jīng)鱟試驗(yàn)法檢測(cè)內(nèi)毒素含量均低于0.025EU/ml。AOPPs含量通過(guò)測(cè)定酸性條件下340nm的光吸收，以氯胺T為標(biāo)準(zhǔn)取得。通過(guò)上述方法所制備的AOPPs-BSA

11、和未經(jīng)修飾的BSA的AOPPs含量分別為65.2±2.12 nmol/mg蛋白和0.2±0.04 nmol/mg蛋白。
　　2.人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)
　　人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞HRGECs細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ScienCell Research Laboratories。細(xì)胞復(fù)蘇后在37℃、5％CO2條件下，用含5％的胎牛血清、1％的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑(ECGS)及100 U/mL青霉素、100mg/L鏈霉素的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。待

12、細(xì)胞生長(zhǎng)至約80％融合時(shí)用于進(jìn)行試驗(yàn)。本研究用2-5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基靜置細(xì)胞24小時(shí)后用于實(shí)驗(yàn)。
　　3.AOPPs誘導(dǎo)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EndMT
　　人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞分別與AOPPs(50、100、200、及400μg/mL)或未經(jīng)修飾的BSA（200μg/mL）共同孵育24小時(shí)，或人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞分別與200μg/mLAOPPs或200μg/mL未經(jīng)修飾的BSA共同孵育12、24、48小

13、時(shí)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志性物CD31、VE-cadherin、claudin5和間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性物FSP-1、α-SMA、及vimentin的mRNA表達(dá)水平
　　4.AOPPs激活人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
　　人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞分別與AOPPs(50、100、200、及400μg/mL)或未經(jīng)修飾的BSA(200μg/mL)共同孵育24小時(shí)，或人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞分別與200μg/mLAOPPs或200μg/m

14、L未經(jīng)修飾的BSA共同孵育12、24、48小時(shí)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性蛋白GRP78和CHOP的mRNA表達(dá)水平
　　結(jié)果：。
　　1.AOPPs誘導(dǎo)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EndMT
　　為了探討AOPPs是否可誘導(dǎo)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EndMT，我們將人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞與AOPPs或未被修飾的BSA共同孵育后檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白CD31、VE-cadherin、claudin5的表達(dá)變化及檢測(cè)間充質(zhì)細(xì)

15、胞特異性標(biāo)志性蛋白FSP-1、α-SMA、及vimentin的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，AOPPs以濃度和時(shí)間依賴方式下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白（CD31、VE-cadherin、及claudin5）的mRNA表達(dá)水平，但以濃度和時(shí)間方式上調(diào)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白(FSP-1、α-SMA、及vimentin)的mRNA表達(dá)水平。然而，未經(jīng)修飾的BSA對(duì)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮標(biāo)志性蛋白及間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯影響，

16、提示這些變化與BSA的氧化修飾有關(guān)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示AOPPs可誘導(dǎo)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞EndMT的發(fā)生。
　　2.AOPPs激活人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)
　　為了探討AOPPs是否會(huì)誘導(dǎo)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，我們使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生的標(biāo)志性蛋白GRP78和CHOP的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，AOPPs組以濃度和時(shí)間依賴方式上調(diào)GRP78和CHOP的mRNA表達(dá)水平。但是未經(jīng)修

17、飾的BSA對(duì)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞GRP78和CHOP的表達(dá)水平無(wú)明顯影響，提示這些變化與BSA的氧化修飾有關(guān)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示AOPPs可誘導(dǎo)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。
　　綜合上述結(jié)果，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)了AOPPs誘導(dǎo)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EndMT的過(guò)程。
　　結(jié)論：
　　本研究證明了AOPPs可誘導(dǎo)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EndMT，還證明了AOPPs可激活人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。然而，未修飾的BSA并不能產(chǎn)生A