脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞體外轉(zhuǎn)分化內(nèi)皮細(xì)胞及鈣調(diào)蛋白拮抗劑W7調(diào)控研究.pdf

1、研究背景:通過組織工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)缺損組織或器官的修復(fù)與替代具有重要的臨床意義。而理想的種子細(xì)胞是組織工程的基礎(chǔ)。對于缺血性疾病而言,利用干細(xì)胞的多向分化潛能進(jìn)行血管重構(gòu)來改善局部缺血的治療模式,是近年來許多學(xué)者關(guān)注的重點(diǎn)。作為候選細(xì)胞的內(nèi)皮祖細(xì)胞,骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞,衛(wèi)星細(xì)胞等,由于取材困難、獲取率低、分化能力和細(xì)胞數(shù)量隨體外傳代培養(yǎng)逐漸下降等應(yīng)用受限,此外更受到倫理學(xué)的質(zhì)疑。脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose—deri

2、vedmesenchymal stem cells,hADSCs)是從成體脂肪組織中分離出來的一類成體干細(xì)胞,具有和骨髓來源的基質(zhì)干細(xì)胞相似的生物學(xué)特性和多系分化潛能,并因其不侵犯相關(guān)倫理及取材方面的優(yōu)勢,有望成為種子細(xì)胞的熱門選擇。為此,建立合理的hADSCs體外培養(yǎng)體系、向內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)分化、以及適當(dāng)載體的尋找都亟待深入研究。
　　 研究目的:第一部分研究:在無血清培養(yǎng)條件下,將人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(hADSCs)分化為

3、內(nèi)皮細(xì)胞,為血管組織工程化種子細(xì)胞的來源和血管新生模型的建立提供基礎(chǔ)。第二部分研究:以(6-氨乙基)-5-氯-1-萘磺酰胺(W7)研究鈣調(diào)蛋白拮抗劑對人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(hADSCs)向內(nèi)皮細(xì)胞分化過程中細(xì)胞表型、細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度變化、成血管功能以及ERK/MAPK信號(hào)通路的作用。第三部分研究:研究人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞與新型可降解多孔生物材料—聚乳酸-聚乙二醇共聚物(Poly(lactic acid)-poly(ethylene

4、 glycol),PLA-PEG)的相容性,及hADSCs在材料上轉(zhuǎn)分化為內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells,ECs)和血管形成的能力。
　　 研究方法:第一部分:從健康人體抽脂術(shù)獲得的脂肪進(jìn)行hADSCs原代培養(yǎng),用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD45、CD44、CD14、CD29及CD105,并分化至成骨和脂肪細(xì)胞,以免疫組化方法檢測其干細(xì)胞的分化能力；然后用含40ng/ml VEGF和10ng/ml bFGF的無血清分化培養(yǎng)基

5、誘導(dǎo)hADSCs分化為內(nèi)皮細(xì)胞,在第15、30、50d通過流式細(xì)胞術(shù)檢測vWF和VE—Cadherin兩種特異性抗原表達(dá),并用透射電鏡檢測WP小體以及成血管實(shí)驗(yàn)來檢測是否分化為內(nèi)皮細(xì)胞。第二部分:以含40ng/ml VEGF和10ng/mlbFGF的干細(xì)胞無血清分化培養(yǎng)基培養(yǎng)P3 hADSCs,將實(shí)驗(yàn)分為空白分化對照組(不含W7的分化培養(yǎng)基),A23187陽性對照組(含50μmol/L鈣離子載體A23187的分化培養(yǎng)基)、高(30μmo

6、l/L)、中(20μ mol/L)、低(10μ mol/L)三個(gè)不同W7劑量的實(shí)驗(yàn)組,及預(yù)先將hADSCs用ERK抑制劑V0126(40μmol/L)處理24h的高(30μmol/L)、中(20μmol/L)、低(10μmol/L)三個(gè)不同W7劑量的對照組。hADSCs加藥8d后,用流式細(xì)胞術(shù)檢測其vWF和VE—Cadherin表型變化,以激光共聚焦顯微鏡檢測Fluo—3標(biāo)記的細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)游離鈣離子濃度變化。同時(shí)將未加抑制劑只用藥物處理2

7、4h的細(xì)胞及加入抑制劑干預(yù)24h后用藥物處理24h的細(xì)胞種植至Matrigel膠上,觀察細(xì)胞成血管能力。利用Western blot技術(shù)分析不同濃度藥物處理8d后細(xì)胞ERK和p—ERK變化。第三部分:選取孔徑為60—80μm和180-200μm的PEG-PLA材料,并計(jì)算不同孔徑該材料14d內(nèi)的吸水率和降解率。利用本室己建立的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法,將hADSCs種植在不同孔徑的材料上,計(jì)算接種率。利用DAPI免疫熒光標(biāo)記及掃描電

8、鏡(scanning electron microscope,SEM).觀察hADSCs在材料上的生長及分布情況,并采用CCK-8法繪制hADSCs在材料上的增殖曲線。用含40ng/mlVEGF和10ng/mlbFGF的分化培養(yǎng)基處理材料上的hADSCs,50d后利用流式細(xì)胞術(shù)檢測vWF和VE—Cadherin及免疫熒光檢測Flk—1觀察hADSCs在材料上分化為ECs的能力。
　　 研究結(jié)果:在第一部分中,分離得到的細(xì)胞流式細(xì)

9、胞術(shù)分析結(jié)果為,CD45(-)CD14(-)CD44(+)CD29(+)CD105(+),表明該細(xì)胞為人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞,并且可分化成骨成脂細(xì)胞。隨著分化時(shí)間的延長,vWF和VE—Cadherin的表達(dá)不斷增加,并且可在電鏡下觀察到WP小體的出現(xiàn)以及在光鏡下觀察到分化50d的hADSCs具有成血管的能力。第二部分中,分化至8d時(shí),與空白分化對照組相比,隨著W7濃度的降低,hAOSCs轉(zhuǎn)分化后的細(xì)胞VE—Cadherin和vWF的表

10、達(dá)量顯著上升(P<0.01),胞質(zhì)內(nèi)游離的鈣離子濃度升高(P<0.01)。藥物作用24h后,藥物干預(yù)組的培養(yǎng)細(xì)胞均有管腔樣血管結(jié)構(gòu)形成,空白分化對照組的細(xì)胞無血管管型形成。與空白分化對照組相比,不同藥物干預(yù)組細(xì)胞ERK表達(dá)水平?jīng)]有顯著性改變(P>0.05),而隨著W7濃度的降低p—ERK表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。在第三部分中,利用已知文獻(xiàn)的方法觀察孔徑分別為60—80μm和180—200μm的PEG—PLA材料14d的吸水率分別

11、為372.73％和245.31％,降解率為9.09％和6.25％。種植hADSCs后,SEM下觀察細(xì)胞呈長梭形依附于多孔材料表面。比較不同孔徑的材料對細(xì)胞的影響發(fā)現(xiàn),60-80μm孔徑的材料細(xì)胞接種率為99.00±0.71％,大于180—200μm孔徑材料上的細(xì)胞接種率92.00±1.22％；但生長曲線卻顯示在180-200μm孔徑材料上細(xì)胞具有更快的增殖速度。選擇180—200μm孔徑的材料進(jìn)行EC分化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),分化50d后,FCM檢

12、測vWF和VE—cadherin的陽性率分別為78.5±1.50和83.3±2.00,免疫熒光化學(xué)檢測Flk-1顯示大多數(shù)細(xì)胞表面均表達(dá)Flk—1。
　　 研究結(jié)論:成功從人體脂肪中分離得到間充質(zhì)干細(xì)胞,并且在無血清條件下可將其分化為內(nèi)皮細(xì)胞。適當(dāng)濃度的鈣離子拮抗劑W7可以顯著促進(jìn)hADSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化,其機(jī)制為通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的增加,激活細(xì)胞分化過程中的ERK/MAPK信號(hào)通路。hADSCs較適合于在孔徑大小為