Dectin-1-磷脂酶Cγ信號(hào)通路在角膜上皮細(xì)胞抗真菌感染固有免疫階段作用的研究.pdf

1、目的：研究在人角膜上皮細(xì)胞抗煙曲霉菌菌絲抗原感染的固有免疫過程中，Dectin-1受體通過胞內(nèi)磷脂酶Cγ（Phospholipase Cγ，PLCγ）信號(hào)傳導(dǎo)通路產(chǎn)生免疫應(yīng)答的作用機(jī)制。
　　方法：常規(guī)體外培養(yǎng)的人角膜上皮細(xì)胞（HCECs），隨機(jī)分為空白對(duì)照組、真菌刺激組和通路受體阻斷組，用煙曲霉菌菌絲抗原感染體外培養(yǎng)的HCECs，建立真菌感染的細(xì)胞模型，此為真菌刺激組，通路受體阻斷組分別用U73122（PLCγ抑制劑）、Pice

2、atannol（Syk抑制劑）及Laminarin（Dectin-1阻斷劑）預(yù)處理30min，后加入煙曲霉菌菌絲抗原刺激液。應(yīng)用Real time-PCR和ELISA技術(shù)方法檢測不同時(shí)間點(diǎn)CXCL1和IL-8 mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況。于5、15、30、45min用Western blot方法檢測通路蛋白 PLCγ及脾酪氨酸激酶（spleen-tyrosine kinase，Syk）的表達(dá)情況。激光掃描共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+

3、變化。
　　結(jié)果：真菌菌絲抗原刺激HCECs后可引起CXCL1和IL-8 mRNA和蛋白水平表達(dá)升高，呈時(shí)間和濃度依賴性，時(shí)間為8h，濃度為5×106/ml時(shí)達(dá)高峰，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；抗原刺激后PLCγ磷酸化水平上調(diào)，30min達(dá)高峰。抑制PLCγ磷酸化能明顯下調(diào)CXCL1和IL-8的表達(dá)（p<0.05）；阻斷Dectin-1受體下調(diào)抗原引起的PLCγ磷酸化水平（p<0.05）。菌絲刺激 HCECs可明顯增強(qiáng)胞內(nèi)

4、Ca2+釋放，U73122和Laminarin預(yù)處理后的胞內(nèi)Ca2+釋放相比菌絲刺激組明顯降低（p<0.05）。菌絲刺激引起Syk磷酸化水平上調(diào)，阻斷Dectin-1受體能下調(diào)Syk的活化（p<0.05）。Syk的抑制也可以使PLCγ的磷酸化水平下調(diào)（p<0.05）。
　　結(jié)論： PLCγ作為Dectin-1的下游分子參與角膜上皮細(xì)胞抗真菌感染。煙曲霉菌菌絲抗原刺激人角膜上皮細(xì)胞可明顯增強(qiáng)胞內(nèi)Ca2+的釋放，Dectin-1/PL