典型多環(huán)芳烴或汞、鉻與過氧化氫酶的相互作用及機(jī)制初探.pdf

1、過氧化氫酶(CAT，EC1.11.1.6)是動植物組織中最重要的抗氧化酶之一，其能催化過氧化氫分解為分子氧和水。近來，許多研究表明一些病理狀態(tài)（如糖尿病、衰老、氧化應(yīng)激和癌癥）與CAT的失活有關(guān)。而環(huán)境中污染物的攝入可能會影響生物體內(nèi)CAT的催化活性。由于環(huán)境污染物的毒性效應(yīng)始于與功能性生物大分子的結(jié)合，因此對環(huán)境污染物與生物大分子相互作用的基礎(chǔ)研究顯得尤為重要。盡管針對一些環(huán)境污染物與CAT在體外相互作用的研究已有開展，但重要環(huán)境污染

2、物對CAT的毒性機(jī)制還遠(yuǎn)遠(yuǎn)未被揭示。因此，本研究關(guān)注于典型PAHs和重金屬汞(Hg)、鉻(Cr)對CAT的毒性作用。為揭示相關(guān)機(jī)制，需要了解PAHs和Hg、Cr是如何與CAT作用的，以及其相互作用對CAT結(jié)構(gòu)和活性的影響。本論文的主要研究內(nèi)容和結(jié)果包括以下幾個方面:
　　(1)利用熒光、紫外-可見吸收和圓二色光譜法研究了模擬條件下(Tris-HCl緩沖液，pH=7.40)1-羥基萘(1-OHNap)、9-羥基菲(9-OHPhe)和

3、1-羥基芘(1-OHPyr)與CAT的相互作用。結(jié)果表明，1-OHNap通過混合猝滅機(jī)制使CAT內(nèi)源熒光猝滅，而9-OHPhe和1-OHPyr對CAT熒光的猝滅屬于靜態(tài)猝滅。1-OHNap、9-OHPhe和1-OHPyr均可與CAT形成1∶1的復(fù)合物，在290 K下其結(jié)合常數(shù)分別為6.31×103、1.03×104和2.96×105 L mol-1。熱力學(xué)分析表明氫鍵和范德華力是形成三種復(fù)合物的主要作用力。根據(jù)F(o)rster非輻射能

4、量轉(zhuǎn)移理論，1-OHNap、9-OHPhe和1-OHPyr與CAT之間的平均結(jié)合距離分別為3.28、4.06和3.48 nm。同步熒光、紫外-可見吸收和圓二色光譜分析表明1-OHNap-CAT、9-OHPhe-CAT和1-OHPyr-CAT復(fù)合物的形成均可引起CAT構(gòu)象的改變。在一定濃度范圍內(nèi)(0-1.0×10-5 mol L-1)，1-OHNap、9-OHPhe和1-OHPyr對CAT活性的影響程度順序?yàn)?-OHNap＜9-OHPhe

5、＜1-OHPyr，其中1-OHNap和1-OHPyr可抑制CAT的活性，而9-OHPhe對CAT活性有促進(jìn)作用。
　　(2)利用分子對接法研究了三種母環(huán)PAHs(萘(Nap)、菲(Phe)和芘(Pyr))及其羥基代謝物(1-OHNap、9-OHPhe和1-OHPyr)與CAT的相互作用。結(jié)果表明，三種母環(huán)PAHs(P-PAHs)及其羥基代謝物(OH-PAHs)可結(jié)合到CAT的不同位點(diǎn)。1-OHNap與ASN323和PHE325殘基

6、，9-OHPhe與ASN368和GLN371殘基，以及1-OHPyr與ASN323和PHE325殘基均可形成氫鍵;而三種P-PAHs與CAT氨基酸殘基之間均無氫鍵形成。通過對接計(jì)算得到Nap-CAT、Phe-CAT、Pyr-CAT、1-OHNap-CAT、9-OHPhe-CAT和1-OHPyr-CAT體系的結(jié)合常數(shù)分別為1.16×104、1.89×105、5.40×105、2.91×104、1.90×105和1.41×106 L mol

7、-1，表明OH-PAHs與CAT的結(jié)合能力要強(qiáng)于P-PAHs?？傮w上，PAHs與CAT的結(jié)合能力與PAHs的辛醇/水分配系數(shù)(logKow)呈正相關(guān)。
　　(3)在模擬條件下，利用熒光、紫外-可見吸收和圓二色光譜法結(jié)合分子對接法研究了無機(jī)二價汞離子(Hg(Ⅱ))與CAT的相互作用。熒光猝滅分析表明Hg(Ⅱ)可通過靜態(tài)猝滅機(jī)制使CAT內(nèi)源熒光猝滅。Hg(Ⅱ)可與CAT結(jié)合形成Hg(Ⅱ)-CAT復(fù)合物，在295 K下其結(jié)合常數(shù)為13.

8、24 Lmol-1。熱力學(xué)分析表明電荷作用力是該復(fù)合物形成的主要作用力。紫外-可見吸收和圓二色光譜分析表明Hg(Ⅱ)-CAT復(fù)合物的形成可引起CAT構(gòu)象變化，在低濃度和高濃度Hg(Ⅱ)存在下可分別增加和降低CAT的α-螺旋含量。Hg(Ⅱ)可明顯抑制CAT的活性，在5.0×10-4mol L-1Hg(Ⅱ)存在下CAT的活性降低了67.2％，且CAT的相對活性值與其熒光強(qiáng)度值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。用分子對接法進(jìn)一步研究了不同形態(tài)的Hg(Ⅱ)(

9、HgCl2，[HgCl3]-和[HgCl4]2-)與CAT的結(jié)合作用。結(jié)果表明，HgCl2，[HgCl3]-和[HgCl4]2-在CAT內(nèi)的結(jié)合位點(diǎn)存在較大差異，三者與CAT的結(jié)合強(qiáng)弱也不同。
　　(4)在模擬條件下，利用多種光譜法結(jié)合分子對接法研究了不同價態(tài)的Cr(Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ))與CAT的相互作用。熒光分析表明Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)均可使CAT熒光發(fā)生猝滅，且分別屬于動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅機(jī)制。Cr(Ⅵ)可與CAT形成復(fù)合

10、物，在298 K下其結(jié)合常數(shù)為3.44×104 L mol-1。此外，熱力學(xué)和分子對接分析表明電荷作用力是形成Cr(Ⅵ)-CAT復(fù)合物的主要作用力，而范德華力也不可忽略。根據(jù)F(o)rster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論，Cr(Ⅵ)和CAT的平均結(jié)合距離為3.55 nm。分子對接結(jié)果表明Cr(Ⅵ)在CAT中的結(jié)合位點(diǎn)靠近CAT的中心區(qū)域，與Cr(Ⅵ)距離在4(A)內(nèi)的氨基酸殘基有9個。模擬計(jì)算得到Cr(Ⅵ)和CAT的結(jié)合常數(shù)為3.03×104 L

11、 mol-1，與實(shí)驗(yàn)值相近。同步熒光、紫外-可見吸收和圓二色光譜分析表明Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)均可使CAT構(gòu)象發(fā)生改變，但影響程度存在差異。低濃度時，Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)均可促進(jìn)CAT的活性，但濃度增加到一定值時對CAT活性的促進(jìn)作用減弱甚至無促進(jìn)。
　　綜上，本文在分子水平上推進(jìn)了對P-PAHs、OH-PAHs、Hg(Ⅱ)、Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)對CAT致毒機(jī)制的闡釋，有助于了解這些環(huán)境污染物對生物體內(nèi)抗氧化酶體系的毒性作用機(jī)