FOXQ1過表達(dá)對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的抗衰老作用及其機制探究.pdf

1、干細(xì)胞是一類具有自我更新能力與多向分化潛能的重要細(xì)胞群體。并且，在阿爾茨海默癥、帕金森癥等研究領(lǐng)域干細(xì)胞轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的研究已經(jīng)取得了豐碩的成果。其中，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cordmesenchymal stem cells， hUC-MSCs）具有取材方便，低免疫原性，分化能力強等等優(yōu)勢，成為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的重要實驗對象。但是，hUC-MSCs在體外培養(yǎng)條件下，隨著操作中不可避免的機械損傷、化學(xué)處理，使得細(xì)胞增殖

2、分化能力也隨之減弱，最為重要的是干細(xì)胞的干性也隨之降低，這成為嚴(yán)重限制hUC-MSCs臨床實驗應(yīng)用的關(guān)鍵點。
　　FOXQ1是叉頭框蛋白家族（Forkhead box Family，F(xiàn)OX）中一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。近年的腫瘤學(xué)研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤組織中，F(xiàn)OXQ1均呈高表達(dá)，且其表達(dá)量與病患的腫瘤惡性程度呈現(xiàn)正相關(guān)。同時，在眾多腫瘤細(xì)胞系中， FOXQ1可以調(diào)控癌細(xì)胞增殖、周期、遷移等過程，進而調(diào)控腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移。體外實驗證明，

3、通過過表達(dá)或敲除FOXQ1，腫瘤細(xì)胞的增殖能力也隨之增強或減弱。以上結(jié)果提示，F(xiàn)OXQ1在腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移中的具有重要意義，可能成為未來腫瘤學(xué)研究中的基因靶點。鑒于 FOXQ1的生物學(xué)功能，研究其能否延緩hUC-MSCs的衰老，促進增殖，能否引起細(xì)胞癌變成為實驗研究的重點，同時，相對眾多腫瘤學(xué)研究，此項研究亦是FOXQ1首次在正常體細(xì)胞中研究，而且， hUC-MSCs中FOXQ1的作用機制尚不明確，需要深入的實驗探究。
　　目的：<

4、br>　　通過慢病毒介導(dǎo)，過表達(dá)FOXQ1基因后，在衰老的hUC-MSCs中，探究體外體內(nèi)條件下，過表達(dá)FOXQ1是否會對hUC-MSCs產(chǎn)生促進增殖、延緩衰老的作用，以及研究FOXQ1在hUC-MSCs中的內(nèi)在調(diào)控機制。
　　方法：
　　1、構(gòu)建FOXQ1過表達(dá)的慢病毒載體并在hUC-MSCs中驗證過表達(dá)效果
　　首先，分離臍帶細(xì)胞并進行表面抗原鑒定。之后，通過 PCR擴增 FOXQ1的CDS序列，將其插入慢病毒載體

5、EcoR I與Xba I酶切位點之間，包裝提取純化病毒液。感染hUC-MSCs并通過藥篩建立穩(wěn)定細(xì)胞系。通過western blot與qPCR檢測過表達(dá)組與空載對照組的FOXQ1表達(dá)量差異。
　　2、體外實驗研究FOXQ1過表達(dá)對hUC-MSCs增殖、衰老等相關(guān)指標(biāo)的影響及其機制探究
　　首先，檢測不同代數(shù)的hUC-MSCs衰老程度與FOXQ1的蛋白表達(dá)量。其次，具體細(xì)胞分組分為P3-hUC-MSCs，P15-hUC-MSC

6、s，P15-Vector-hUC-MSCs（病毒空載對照組），P15-FOXQ1-hUC-MSCs（病毒過表達(dá)組）。通過CCK-8檢測細(xì)胞增殖，SA-β-gal檢測細(xì)胞衰老。western blot與qPCR檢測衰老相關(guān)基因（P16、P21、P53、SIRT1、PCNA）表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化。熒光法鑒定細(xì)胞凋亡情況。Transwell小室檢測細(xì)胞遷移能力變化。最后，qPCR檢測不同組間加入 SIRT1抑制劑 EX527前后的

7、衰老相關(guān)分泌表型（ SASP, senescence associated secretory phenotype）水平變化（主要是IL-6、IL-8）。
　　3、體內(nèi)實驗通過檢測FOXQ1過表達(dá)后的hUC-MSCs對APP+鼠的治療效果，反映過表達(dá)后hUC-MSCs在體內(nèi)條件下的存活與增殖能力的變化
　　首先，體內(nèi)實驗分組，共計6組，分別是WT組（C57BL/6鼠，非治療對照組），APP+（非治療對照組），P3（P3代干細(xì)

8、胞治療組），P15（P15代干細(xì)胞治療組），P15-Vector（P15代病毒空載干細(xì)胞治療組），P15-FOXQ1（P15代過表達(dá)FOXQ1干細(xì)胞治療組）。PCR鑒定APP+和WT鼠。取五月齡SPF級小鼠，每組10只，共計60只。經(jīng)過一個月干細(xì)胞注射治療后，通過莫氏水迷宮檢測小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化。處死小鼠后，取血清檢測SOD含量。取全腦，免疫組化檢測小鼠海馬MAB1281表達(dá)情況。提取海馬蛋白，檢測衰老相關(guān)基因P16、P21、P53

9、、SIRT1、SIRT2、PCNA，以及AD致病相關(guān)蛋白tau、p-tau(ser396)， p-tau（ser235）的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1、流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，符合hUC-MSCs表面抗原表達(dá)情況，不表達(dá) CD29(99.8％), CD90(99.5%), HLA-ABC(99.6%)；高表達(dá)CD34(99.2%), CD45(99.9%),HLA-DR(99.6%)。FOXQ1過表達(dá)慢病毒重組載體構(gòu)建成功，F(xiàn)

10、OXQ1過表達(dá)組hUC-MSCs的 FOXQ1蛋白及 mRNA表達(dá)水平較病毒空載組有極顯著升高（P<0.01）。
　　2、通過western blot與SA-β-gal檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著干細(xì)胞的衰老，F(xiàn)OXQ1的表達(dá)也隨之下降。CCK-8結(jié)果顯示，F(xiàn)OXQ1過表達(dá)組較空載組細(xì)胞增殖能力有顯著增強（P<0.05），SA-β-gal染色結(jié)果提示，過表達(dá)組的藍(lán)染率較空載組明顯下降（P<0.01）。蛋白水平檢測結(jié)果顯示，過表達(dá)組的衰老正相

11、關(guān)蛋白 p16（P<0.01）、p21（P<0.05）、p53（P<0.05）表達(dá)均低于空載組，衰老負(fù)相關(guān)蛋白SIRT1（P<0.01）、PCNA（P<0.05）均明顯高于對照組。mRNA表達(dá)水平上P16（P<0.05）、P21（P<0.01）、P53（P<0.05），SIRT1（P<0.05）、PCNA（P<0.05）的表達(dá)呈現(xiàn)出相同趨勢。FOXQ1過表達(dá)后，hUC-MSCs其增殖能力增強，但細(xì)胞仍會隨著代數(shù)增加而衰老，細(xì)胞分裂能力增

12、強，并未達(dá)到無限增殖能力，傳代過程中未出現(xiàn)癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。在細(xì)胞遷移能力方面，F(xiàn)OXQ1過表達(dá)可以顯著促進細(xì)胞遷移能力。通過熒光法分析，F(xiàn)OXQ1可以顯著減少細(xì)胞凋亡。在SASP探究中，F(xiàn)OXQ1過表達(dá)組較空載組，其IL-6（P<0.01），IL-8（P<0.05）表達(dá)水平明顯較低。當(dāng)FOXQ1過表達(dá)組加入SIRT1抑制劑EX527后，其SASP表達(dá)水平上升，接近至空載組水平（P<0.05）。
　　3、各組小鼠水迷宮實驗結(jié)果顯示

13、，F(xiàn)OXQ1過表達(dá)治療組的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力有著顯著提升，其逃避潛伏期，穿越平臺次數(shù)，平臺象限停留時間均有明顯高于對照組（P<0.05）。小鼠海馬 MAB1281免疫組化染色結(jié)果顯示，F(xiàn)OXQ1過表達(dá)組的海馬區(qū)域細(xì)胞遷移率較對照組有顯著提升（P<0.05），血清SOD含量明顯升高（P<0.05）。小鼠海馬部分western blot檢測結(jié)果顯示，衰老正相關(guān)蛋白 P21、P53，過表達(dá)組明顯低于對照組（P<0.05），P16差異不顯著。衰老

14、負(fù)相關(guān)蛋白SIRT1、SIRT2、PCNA，過表達(dá)組明顯高于對照組（P<0.05）。AD致病相關(guān)蛋白，tau蛋白差異不顯著，對于磷酸化tau蛋白水平p-tau(ser396)，p-tau（ser235）（P<0.05），F(xiàn)OXQ1過表達(dá)組表達(dá)水平明顯低于對照組水平。
　　結(jié)論：
　　1、臍帶分離的細(xì)胞符合hUC-MSCs表面抗原表達(dá)。FOXQ1慢病毒過表達(dá)載體系統(tǒng)可以有效提高其在hUC-MSCs中的表達(dá)，蛋白水平及mRNA水