間充質(zhì)干細(xì)胞逆轉(zhuǎn)大鼠衰老的作用.pdf

1、背景與目的：
　　 中國(guó)正快速步入老齡化社會(huì),目前中國(guó)60歲以上老年人有約1.69億。預(yù)計(jì)2050年中國(guó)60歲以上老年人將占三成,老齡化帶來(lái)的種種困擾和問(wèn)題更加嚴(yán)重。衰老和死亡是任何物種的個(gè)體都難以避免的最終結(jié)局,但至今我們對(duì)衰老發(fā)生機(jī)制的理解還相當(dāng)有限。鑒于其重要性,衰老一直是生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。
　　 經(jīng)過(guò)多年的研究,現(xiàn)在關(guān)于衰老的機(jī)制已經(jīng)提出多種學(xué)說(shuō),每種學(xué)說(shuō)都有其優(yōu)勢(shì)和不足。諸如自由基學(xué)說(shuō)、遺傳程序?qū)W說(shuō)、差錯(cuò)災(zāi)難學(xué)

2、說(shuō)、交聯(lián)學(xué)說(shuō)、脂褐素累積學(xué)說(shuō)、內(nèi)分泌功能減退學(xué)說(shuō)等,分別從不同的角度探討了衰老發(fā)生的機(jī)制和對(duì)策。近50年的理論和實(shí)驗(yàn)證實(shí),自由基學(xué)說(shuō)是最有說(shuō)服力的衰老學(xué)說(shuō)之一。
　　 給動(dòng)物連續(xù)注射D-半乳糖后,因其代謝產(chǎn)物半乳糖醇不能進(jìn)一步代謝而堆積在細(xì)胞內(nèi),導(dǎo)致細(xì)胞腫脹,致使動(dòng)物組織細(xì)胞出現(xiàn)衰老的退行性變以及功能的改變。同時(shí)D-半乳糖在體內(nèi)產(chǎn)生的大量自由基超過(guò)機(jī)體的清除能力,引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng),產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛,加重對(duì)細(xì)胞

3、的損傷。D-半乳糖致衰老動(dòng)物模型的造模方法簡(jiǎn)便易行,價(jià)格低廉,結(jié)果穩(wěn)定,目前已成為國(guó)內(nèi)公認(rèn)的衰老動(dòng)物模型。因此本實(shí)驗(yàn)采取D-半乳糖制備亞急性衰老模型。
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是來(lái)源于胚胎發(fā)育早期中胚層的一類多能干細(xì)胞,是全身結(jié)締組織的干細(xì)胞。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)MSCs在合適的體外分化條件下,不僅可以分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞,而且可以跨胚層

4、分化為外胚層的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)胚層的肝細(xì)胞。并且MSCs具有移植后不發(fā)生排斥反應(yīng)的特點(diǎn)。隨著對(duì)MSC的深入研究,目前認(rèn)為MSCs除了具有多向分化潛能,還能在損傷局部反應(yīng)性分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。這些因子能夠促進(jìn)局部血管增生、組織再生等,從而起到了治療損傷的作用。
　　 近年來(lái)隨著對(duì)衰老的深入研究,目前認(rèn)為衰老是一種與基因相關(guān)的疾病,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些基因與細(xì)胞衰老密切相關(guān)。它們可概括為細(xì)胞周期調(diào)控基因、端粒酶調(diào)控基因、生長(zhǎng)抑制蛋

5、白基因、DNA/蛋白質(zhì)合成與修復(fù)基因等。衰老還與一些轉(zhuǎn)錄因子(反式作用因子)的基因表達(dá)或活性改變有關(guān)。其中具有細(xì)胞增殖調(diào)控功能的衰老有關(guān)基因有抑癌基因p21、抑癌基因p16、抑癌基因p53、細(xì)胞周期素D1(cyclin D1)、周期素依賴性激酶2(cycli-n-dependent kinase2,CDK2)、視網(wǎng)膜神經(jīng)母細(xì)胞瘤蛋白(Rb)、增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating CellNuclear Antigen,PCNA)、

6、轉(zhuǎn)錄因子(A-P-1、E2F)等。這些基因之間相互聯(lián)系,可能構(gòu)成細(xì)胞衰老的基因調(diào)控鏈。所以本課題將初步探討MSC是否會(huì)影響p16、p21及PCNA的表達(dá),這可能是間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮抗衰老作用的機(jī)制之一。
　　 綜上所述,我們擬在研究間充質(zhì)干細(xì)胞逆轉(zhuǎn)衰老的作用,并且從衰老相關(guān)基因來(lái)探討MSCs抗衰老的機(jī)制。本研究將為間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮抗衰老提供理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。如能取得預(yù)期效果,經(jīng)過(guò)良好設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)研究后,其臨床前景廣闊。
　　

7、實(shí)驗(yàn)方法：
　　 第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定
　　 用貼壁培養(yǎng)法分離、純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,為MSCs的生物治療奠定基礎(chǔ)。無(wú)菌條件下取大鼠股骨和脛骨,收集細(xì)胞懸液。離心后加入含10％胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基,接種于培養(yǎng)瓶中,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80-90％融合時(shí)傳代。取生長(zhǎng)良好的P3代MSCs進(jìn)行檢測(cè):
　　 ①觀察MSCs形態(tài)并做蘇木精-伊紅染色。
　　 ②MTT法和

8、克隆形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定生長(zhǎng)曲線和克隆形成能力；
　　 ③流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSCs細(xì)胞表面抗原標(biāo)記和細(xì)胞增殖周期；
　　 ④在地塞米松、左旋Vit C、β-磷酸甘油等作用下向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化；在地塞米松、重組人胰島素的作用下向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化。
　　 第二部分制備衰老模型,研究間充質(zhì)干細(xì)胞在衰老大鼠體內(nèi)的遷移。
　　 ①衰老模型的制備選用清潔級(jí)SD大鼠,每日皮下注射D-半乳糖400mg/kg,連續(xù)注射4個(gè)月,制作衰

9、老模型。取大鼠血清,測(cè)定各組大鼠血清中SOD活性和MDA含量。
　　 ②分別從青年對(duì)照組和衰老模型大鼠的骨髓中培養(yǎng)出間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況,流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)表面抗原,比較兩組原代細(xì)胞集落形成數(shù)量和增殖情況,透射電鏡觀察其形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化。
　　 ③體外培養(yǎng)純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞至第三代,用表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的病毒載體轉(zhuǎn)染MSCs細(xì)胞,在顯微鏡下觀察未轉(zhuǎn)染MSCs和轉(zhuǎn)染

10、MSCs的形態(tài)并在熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況,檢測(cè)MSCs-GFP的細(xì)胞活性和細(xì)胞周期,通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志(CD29,CD34,CD44,CD45)表達(dá)的影響。
　　 ④調(diào)整GFP標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞濃度為3×107/mL,將3×106個(gè)MSCs通過(guò)尾靜脈回輸給衰老大鼠,應(yīng)用熒光顯微鏡檢測(cè)MSCs的遷移。
　　 第三部分間充質(zhì)干細(xì)胞逆轉(zhuǎn)衰老的效果
　　 SD大鼠30只,隨機(jī)均分為3組:對(duì)照組、

11、衰老模型組和MSCs治療組。衰老模型組大鼠每日皮下注射D-半乳糖400mg/kg,連續(xù)4個(gè)月。MSCs治療組在衰老模型制備成功后,給予尾靜脈輸注3×106個(gè)MSCs。
　　 ①實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,取大鼠血清,測(cè)定各組大鼠血清中SOD和MDA；全自動(dòng)分析儀及酶標(biāo)儀檢測(cè)雌二醇(E2)、孕酮(P)、促黃體生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)、睪酮(T)；以及血鈣(Ca)、堿性磷酸酶(ALP)。
　　 ②取各組大鼠胸腺、脾臟、卵巢和睪丸

12、,HE染色后,觀察各組織結(jié)構(gòu)的差異。
　　 ③稱重法測(cè)定大鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)；用MTT法測(cè)定脾臟淋巴細(xì)胞增殖活性；ELISA法測(cè)定胸腺IL-7、IL-10和IL-2含量,以及脾臟IL-10和IL-2的含量；流式細(xì)胞儀檢測(cè)胸腺中CD4+CD8+T細(xì)胞:透射電鏡檢測(cè)胸腺組織結(jié)構(gòu)。
　　 ④骨密度掃描儀測(cè)量各組大鼠骨密度(BMD)；利用掃描電鏡對(duì)大鼠股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。
　　 第四部分 MSCs治療衰老

13、的機(jī)制研究
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),處死各組大鼠,無(wú)菌條件下提取各個(gè)組織,應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)各組織中P16、P21和PCNA mRNA的表達(dá)。應(yīng)用免疫印記法檢測(cè)各組織中P16、P21、PCNA蛋白的表達(dá)。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　 試驗(yàn)資料結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±S)表示,顯著性標(biāo)準(zhǔn)為0.05,采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間比較用單因素方差分析(One-Way ANOVA)；組間兩兩顯

14、著性比較方差齊采用LSD法,方差不齊用Dunnett's T3和Ounnett's C法；分析各因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)用析因方差分析；重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)用重復(fù)測(cè)量方差分析；兩個(gè)獨(dú)立樣本的總體均數(shù)比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定
　　 利用貼壁篩選的方法分離大鼠骨髓MSCs,經(jīng)傳代后細(xì)胞形態(tài)呈梭形,均勻一致。將P3代細(xì)胞低密度接種到培養(yǎng)板,培養(yǎng)1周后可形成散在分布的克隆

15、。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線分析結(jié)果顯示接種后第三天細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期,至第五天進(jìn)入平臺(tái)期。MSCs細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示G0+G1期的細(xì)胞約占80％以上。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示P3代細(xì)胞均一地表達(dá)細(xì)胞表面抗原CD44、CD29,不表達(dá)CD34和CD45。經(jīng)定向誘導(dǎo)分化后,細(xì)胞分別呈現(xiàn)成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞的表型特征。
　　 第二部分制備衰老模型,研究間充質(zhì)干細(xì)胞在衰老大鼠體內(nèi)的遷移。
　　 ①成功制備了D-半乳糖致亞急性衰老大鼠模型。與對(duì)照組

16、相比,衰老模型組SOD的活性明顯降低,MDA含量明顯降低升高,差異有顯著性意義(P<0.01)。
　　 ②青年組和衰老模型組的原代和第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在形態(tài)上無(wú)差異；流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示,兩組MSCs的免疫表型一致；兩組細(xì)胞也都具有成骨誘導(dǎo)和成脂誘導(dǎo)能力。但與青年對(duì)照組相比,衰老模型組MSCs生長(zhǎng)速度明顯減慢,集落形成單位明顯降低(P<0.05)。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),衰老模型組MSCs呈現(xiàn)衰老的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化。
　　 ③

17、GFP轉(zhuǎn)染后24 h即可見(jiàn)綠色熒光蛋白表達(dá),72 h表達(dá)最強(qiáng),此后逐漸減弱,到4周時(shí)仍可見(jiàn)少量表達(dá)。并且GFP對(duì)MSCs細(xì)胞的增殖、細(xì)胞形態(tài)、周期及表面抗原的表達(dá)均無(wú)影響。
　　 ④綠色熒光蛋白標(biāo)記MSCs回輸?shù)剿ダ洗笫篌w內(nèi),MSCs能夠歸巢到衰老大鼠的胸腺、脾臟、卵巢、睪丸。MSCs歸巢到衰老大鼠體內(nèi)第7天時(shí),歸巢的組織仍有熒光存在。
　　 第三部分間充質(zhì)干細(xì)胞逆轉(zhuǎn)衰老的效果
　　 ①與衰老模型組相比,MSCs

18、治療組SOD的活性明顯升高,MDA含量明顯降低,差異有顯著性意義(P<0.05)。酶標(biāo)儀檢測(cè)雌性大鼠血清中激素的水平,結(jié)果顯示,MSCs治療組與模型組相比,能夠升高大鼠體內(nèi)P、E2及睪酮的含量；能夠降低LH、FSH的含量(P<0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組大鼠的血清鈣、堿性磷酸酶含量測(cè)定結(jié)果:與正常對(duì)照組比較,衰老模型組血清鈣和ALP有所升高(P<0.05)；而MSCs治療組與致衰老模型組相比,血清鈣、ALP則明顯降低(P<0.0

19、5)。
　　 ②MSCs治療組與模型組相比,能使胸腺、脾臟、睪丸和卵巢的結(jié)構(gòu)得到明顯改善:于100倍光鏡下檢測(cè)睪丸中不同萎縮程度曲細(xì)精管的百分比。結(jié)果顯示,治療組與模型組相比,能夠提高正常生精管的比例,減少部分萎縮管及完全萎縮管的比例(P<0.05)。與模型組相比,治療組的卵巢中黃體和卵泡數(shù)日增多(P<0.05),組間比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 ③間充質(zhì)干細(xì)胞可增強(qiáng)衰老模型大鼠的免疫功能,顯著提高衰老大鼠的胸腺指數(shù)

20、和脾臟指數(shù),增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞活性,同時(shí)增加IL-2和IL-7的表達(dá)水平；降低IL-10的表達(dá)水平。衰老模型組CD4+CD8+T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)明顯低于對(duì)照組；
　　 治療組與模型組比較,其百分?jǐn)?shù)明顯升高,差異具有顯著性(P<0.01)。胸腺組織的透射電鏡分析結(jié)果:MSCs治療組與模型組相比,能使胸腺組織結(jié)構(gòu)得到明顯改善。
　　 ④骨密度掃描儀測(cè)量骨密度(BMD):MSCs治療組與致衰老模型組相比,全身BMD有所升高(P<0.0

21、5),股骨BMD明顯升高(P<0.05)。掃描電鏡結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,模型組大鼠的骨小梁變細(xì),斷裂,數(shù)量減少,微損傷增多:而治療組與模型組大鼠相比,骨小梁數(shù)量增加,骨吸收面減少,膠原纖維排列規(guī)律、整齊。
　　 第四部分 MSCs逆轉(zhuǎn)衰老的機(jī)制研究
　　 Real-time PCR檢測(cè)各組織中P16、P21和PCNA mRNA的表達(dá)結(jié)果顯示:與模型組相比,治療組中大鼠各組織內(nèi)P16和P21 mRNA的表達(dá)降低,而PCN

22、AmRNA的表達(dá)升高(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示:治療組P16及P21蛋白表達(dá)低于模型組；而PCNA蛋白表達(dá)明顯高于模型組。
　　 結(jié)論：
　　 1.本實(shí)驗(yàn)建立了一種體外穩(wěn)定培養(yǎng)擴(kuò)增大鼠MSCs的方法,培養(yǎng)的細(xì)胞成分單一,通過(guò)觀察細(xì)胞生物學(xué)特性、流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞表面抗原結(jié)果符合MSCs標(biāo)準(zhǔn)。適用于對(duì)BMSCs進(jìn)一步的應(yīng)用研究。
　　 2.衰老模型組的間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)目和功能都發(fā)生了改變,推

23、測(cè)隨著大鼠衰老,MSCs細(xì)胞可能也會(huì)隨著衰老。因此移植青年大鼠MSCs對(duì)移植治療會(huì)有更好的效果。
　　 3.GFP熒光穩(wěn)定持久,對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生物學(xué)特征無(wú)明顯影響,并且其熒光表達(dá)時(shí)間達(dá)4周,因此可以將其作為間充質(zhì)干細(xì)胞的示蹤標(biāo)記。經(jīng)尾靜脈移植的MSCs能夠較長(zhǎng)時(shí)間定位于衰老大鼠的各器官。
　　 4.本實(shí)驗(yàn)從功能水平、生化水平及細(xì)胞水平檢測(cè),發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞能夠修復(fù)衰老所致大鼠組織的損傷,具有治療大鼠衰老的作用。
　　

24、 5.MSCs可明顯下調(diào)p16和P21,上調(diào)PCNA的表達(dá),可能是其逆轉(zhuǎn)衰老的機(jī)制之一。
　　 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)：
　　 1.對(duì)免疫系統(tǒng)、骨質(zhì)疏松的作用:間充質(zhì)干細(xì)胞可增強(qiáng)老年大鼠免疫功能:MSCs細(xì)胞可以修復(fù)D-半乳糖所致骨質(zhì)疏松癥。
　　 2.衰老模型大鼠MSCs的生長(zhǎng)速度和增殖能力發(fā)生了改變,因此移植青年大鼠MSCs作為種子細(xì)胞,對(duì)移植治療會(huì)有更好的效果。
　　 3.通過(guò)Real-time PCR和