間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠衰老的研究.pdf

1、近年來(lái)隨著對(duì)衰老的研究發(fā)現(xiàn)，目前認(rèn)為衰老是一種與基因相關(guān)的疾病，在衰老細(xì)胞中起重要作用的是P53及P16抑癌基因。P53基因在細(xì)胞的生長(zhǎng)周期、凋亡、衰老等過(guò)程中扮演著很重要的角色，P53基因是重要的細(xì)胞周期、凋亡調(diào)節(jié)基因，活化的P53可以影響許多基因的表達(dá)。因此P53基因被認(rèn)為是影響人類(lèi)壽命的一個(gè)關(guān)鍵基因。P16基因也是一種重要的抑癌基因，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)它在細(xì)胞衰老過(guò)程中起重要作用，它在復(fù)制衰老時(shí)多呈高表達(dá)。P16基因?qū)?xì)胞衰老的調(diào)控細(xì)胞增

2、殖周期的調(diào)控與個(gè)體發(fā)育、分化、生長(zhǎng)、衰老及癌變都有密切關(guān)系。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞衰老時(shí)，P16基因的mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平增高，抑制細(xì)胞有絲分裂，刺激發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生RB蛋白的磷酸化，從而維持了衰老細(xì)胞不可逆的生長(zhǎng)停滯狀態(tài)，所以本實(shí)驗(yàn)將初步探討MSCs是否具有影響P53及P16表達(dá)的作用，這可能也是MSCs抗衰老的機(jī)制之一。 本研究不是從MSCs的多組織分化功能來(lái)探討MSC抗衰老的機(jī)制，而且是從MSCs分泌的細(xì)胞因子的功能來(lái)探討

3、MSCs是否具有抗大鼠衰老的作用及其作用機(jī)制。為MSCs的生物治療打開(kāi)另一個(gè)全新的思路。 實(shí)驗(yàn)方法: 第一部分:大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 實(shí)驗(yàn)在無(wú)菌條件下分離大鼠肱骨、股骨和脛骨，用PBS緩沖液沖出骨髓，離心后接種含10%胎牛血清（FBS）的L-DMDM培養(yǎng)基中，按2×106/c㎡密度接種于培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第三天半量換液，第六天用PBS沖洗三遍后全量換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80-90%融合時(shí)，消化傳代。

4、倒置光顯微鏡和蘇木精-伊紅染色（HE染色）進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期分析，MTT法和克隆形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞P1和P5生長(zhǎng)曲線和克隆形成能力，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD34、CD45、CD29及CD44的表達(dá)，進(jìn)行細(xì)胞鑒定，從而為本實(shí)驗(yàn)提供大量的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。 第二部分:MSCs在衰老大鼠體內(nèi)歸巢的研究 ①體外實(shí)驗(yàn)：采用終濃度分別為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0μM的CFSE在1、

5、5、10min三個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)標(biāo)記MSCs，用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡來(lái)篩選CFSE標(biāo)記MSCs的理想條件；采用MTT方法檢測(cè)在此理想條件下CFSE對(duì)MSCs的增殖是否有影響；應(yīng)用HE染色觀察在此理想條件下CFSE對(duì)MSCs的細(xì)胞形態(tài)學(xué)是否有影響；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)在此理想條件下CFSE對(duì)MSCs的周期及表面抗原的表達(dá)是否有影響；應(yīng)用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡檢測(cè)在此理想條件下CFSE跟蹤MSCs的最大時(shí)限。 ②體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：采用此理想條

6、件下的熒光染料CFSE標(biāo)記MSCs，標(biāo)記的MSCs以3×105個(gè)尾靜脈分別注射衰老及正常大鼠體內(nèi)，于第1、第3、第6天后處死大鼠，將各個(gè)組織制作成冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察；分別取各個(gè)組織，研磨后經(jīng)300目篩網(wǎng)過(guò)濾，取各個(gè)組織1×106個(gè)細(xì)胞制作懸液涂片，在熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)，從而研究MSCs的歸巢，為MSCs治療衰老奠定基礎(chǔ)。 第三部分:MSCs治療衰老的效果的研究 皮下注射D-半乳糖，連續(xù)3個(gè)月，建立衰老大鼠模

7、型。以每周一次大鼠尾靜脈注射3×106個(gè)MSCs，連續(xù)4周進(jìn)行治療，常規(guī)飼養(yǎng)大鼠1個(gè)月后，腹腔注射氯胺酮麻醉大鼠，提取大鼠血清應(yīng)用全自動(dòng)分析儀及酶標(biāo)儀檢測(cè)血清中肌酐、尿素、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬門(mén)氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）及雌性大鼠體內(nèi)孕酮（P）、雌二醇（E2）、黃體生成素（LH）、血促卵泡激素（FSH），雄性大鼠體內(nèi)睪酮（T）的水平；采用硫代巴比妥酸和黃嘌呤氧化法分別檢測(cè)血清和各個(gè)組織中丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（S

8、OD）活性；制作各個(gè)組織常規(guī)石蠟切片，觀察三組大鼠各個(gè)組織結(jié)構(gòu)的差異，從功能學(xué)水平，生化水平及細(xì)胞水平研究MSCs是否具有治療衰老的作用。 第四部分:MSCs治療衰老的機(jī)制的研究 皮下注射D-半乳糖建立大鼠衰老模型，大鼠尾靜脈注射3×106個(gè)MSCs進(jìn)行生物治療；每周治療一次，連續(xù)治療四次，常規(guī)飼養(yǎng)大鼠1個(gè)月后，處死各組大鼠，無(wú)菌條件下提取各個(gè)組織，應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)各個(gè)組織器官中VEGFR、FGFR、P

9、53及P16的表達(dá)；應(yīng)用免疫印記法檢測(cè)各組組織中VEGF、bFGF、P53及P16蛋白的表達(dá)，從而研究MSCs是否通過(guò)與各個(gè)組織細(xì)胞相互接觸分泌VEGF和bFGF來(lái)治療衰老，同時(shí)探討MSCs是否通過(guò)改變P53及P16的表達(dá)來(lái)治療衰老。 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法: 實(shí)驗(yàn)資料結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）表示，顯著性標(biāo)準(zhǔn)為0.05，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA）；重復(fù)測(cè)量數(shù)

10、據(jù)用重復(fù)測(cè)量方差分析（Reperted measurement experiment）；組間兩兩顯著性比較方差齊采用LSD法，方差不齊用Dunnett T3；各組治療前后比較用配對(duì)t檢驗(yàn)。相關(guān)性采用偏相關(guān)分析（Partial correlation analysis）。 結(jié)論: 1、本實(shí)驗(yàn)方法能有效地提高大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的獲得率和擴(kuò)增率，本實(shí)驗(yàn)采用貼壁法培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞經(jīng)鑒定為大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞； 2、熒光染料C

11、FSE適用于長(zhǎng)期標(biāo)記MSCs，熒光染料CFSE標(biāo)記MSCs的理想條件為中濃度為20μM，與MSCs作用5分鐘，此理想濃度對(duì)MSCs無(wú)影響； 3、MSCs能夠較長(zhǎng)時(shí)間定位于衰老大鼠的腦、心、肝、肺、脾、腎、睪丸、卵巢及腸道，并與正常大鼠具有相同的歸巢趨勢(shì)； 4、本實(shí)驗(yàn)從功能水平、生化水平及細(xì)胞水平檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MSCs具有延緩大鼠衰老的效果，具有治療大鼠衰老的作用； 5、本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：MSCs分泌VEGF及bFGF細(xì)

12、胞因子，誘導(dǎo)各個(gè)組織器官內(nèi)VEGFR、FGFR表達(dá)增高；可能是其治療衰老的機(jī)制之一； 6、本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：MSCs能夠降低P53、P16的表達(dá)，這可能是其治療衰老的機(jī)制之一； 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)： 1、本研究從補(bǔ)充種子細(xì)胞方面入手，能夠從根本上解決衰老問(wèn)題； 2、本實(shí)驗(yàn)從MSCs分泌的細(xì)胞因子來(lái)探討MSCs是否具有抗大鼠衰老的作用及其作用機(jī)制，為生物治療退行性變打開(kāi)另一個(gè)全新的思路； 3、MSCs能夠