Gli1陽性的間充質(zhì)干細胞在損傷誘導(dǎo)的異位骨化發(fā)生發(fā)展中的研究.pdf

1、【研究背景】
　　異位骨化(Heterotopic Ossification, HO)是指在正常骨骼系統(tǒng)之外（如：肌肉，跟腱等組織）的真正成骨。一般分為兩類，第一類是創(chuàng)傷誘導(dǎo)的獲得性的異位骨化。常發(fā)生于脊髓、神經(jīng)損傷，大面積燒傷、燙傷，關(guān)節(jié)置換手術(shù)，矯形手術(shù)，戰(zhàn)時創(chuàng)傷等。對于其發(fā)病機理，至今依然并不清楚。臨床治療措施相對單一，如手術(shù)切割，放射治療，和非甾類抗炎藥的使用，但是效果，預(yù)后都不甚好。當前遇到的最大的困難就是，即使使用物理

2、化學(xué)手段將病變骨化區(qū)域摘除，只有一定緩解的作用，依然有大部分的患者會出現(xiàn)復(fù)發(fā)的現(xiàn)象。另外一種則是相對比較嚴重的，遺傳性的異位骨化。常見有骨形態(tài)發(fā)生蛋白Ⅰ類受體ACVR1功能獲得性突變導(dǎo)致的進行性骨化纖維發(fā)育不良（Fibrodysplasia Ossificans Progressiva，F(xiàn)OP），以及編碼 Gα蛋白基因 GNAS缺失突變引起的進行性骨發(fā)育異常（Progressive Osseous Heteroplasia, POH）。

3、由于其一旦發(fā)病，難以逆轉(zhuǎn)，所以當前對其研究較多。據(jù)報道，BMP-SMAD信號通路以及BMP-MAPK信號通路調(diào)控細胞向成骨分化進而調(diào)控異位骨化的進程。但是由于FOP病人一旦接受創(chuàng)傷誘導(dǎo)，將持續(xù)性異位成骨，最終失去生命，因而大多數(shù)研究都是停留在FOP病人的外周血，新生脫落的組織如乳牙等?？偟膩碚f，遺傳性的異位骨化研究較為透徹，但是關(guān)于獲得性的異位骨化，其發(fā)病原因多變，機理不明，發(fā)生率較高，社會影響較大，且治療手段缺乏，所以獲得性的異位骨化

4、理應(yīng)引起我們的重視。
　　關(guān)于異位骨化的細胞起源，一直都有爭議，有些學(xué)者認為是由內(nèi)胚層的細胞，如內(nèi)皮細胞，通過內(nèi)皮細胞間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化成間質(zhì)細胞參與異位骨的形成。甚至有人提到是由外胚層細胞發(fā)育而來。但是，主流的觀點還是認為由中胚層的細胞，如間充質(zhì)干細胞通過向軟骨細胞,成骨細胞分化增殖來參與異位骨的形成。
　　間充質(zhì)干細胞，當前研究很熱的一種成體干細胞，首次被發(fā)現(xiàn)于骨髓中一類區(qū)別與造血干細胞，但是有向軟骨細胞，成骨細胞，成脂細胞的分

5、化潛能，同時又是具有克隆形成能力的貼壁細胞。后來，又相繼在胎盤，乳牙，骨，軟骨，脂肪，骨骼肌，子宮內(nèi)膜等組織中被發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)在被廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)，甚至是癌癥治療。其最大的特點就是具有較低的免疫原性和多向分化能力。經(jīng)證實，間充質(zhì)干細胞在體外可以分化為骨細胞，軟骨細胞，脂肪細胞，甚至是心肌細胞，神經(jīng)元。正由于其與骨骼系統(tǒng)密切相關(guān)，并且分布區(qū)域符合異位骨化發(fā)生的條件，所以被認為是異位骨化真正的細胞來源，我們前期的研究也表明，Glast陽性的干細

6、胞/前體細胞直接參與了異位骨化各個階段的形成。并且這些Glast陽性的細胞表達間充質(zhì)干細胞的相對特異的marker，這就在一定程度中佐證了間充質(zhì)干細胞參與異位骨化的假設(shè)。另外，已有報道正式參與異位骨化形成的其他細胞亞群，如：Tie2+，Mx1+，Scx+細胞，也都被證實很有可能是間質(zhì)來源。
　　最近，有學(xué)者證實膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源基因1（Glioma-associated oncogene homolog1，Gli1）蛋白是間充質(zhì)

7、干細胞的表面分子標志物（marker），而Gli1是Hedgehog（Hh）信號通路中一個至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子，并且，Hh信號通路參與調(diào)控正常骨的發(fā)育，尤其是軟骨內(nèi)骨化。所以這引起我們極大的興趣去探究Hh信號通路在HO中到底扮演了什么角色。
　　另外，CD133最近也被作為間質(zhì)細胞的一個marker，尤其是造血干細胞和肌肉衛(wèi)星細胞，值得一提的是肌肉衛(wèi)星細胞，據(jù)報道也與異位骨化的形成有著密切的關(guān)系。所以本課題組提出假說，在具有FOP表

8、型的Nse-Bmp4轉(zhuǎn)基因鼠中，Gli1+和CD133+細胞是否都會直接參與異位骨化的進程，并進一步探究Gli1和CD133分別標記什么樣的細胞。這不僅給異位骨化的發(fā)病機制研究甚至是治療帶來一線新的希望，另外對于間充質(zhì)干細胞的在體研究也有著深遠的意義。
　　【研究方法】
　　1.從國外引進Nse-BMP4小鼠模型，將其與Gli1-CreERT或者CD133-creERT小鼠進行交配，篩選出雙陽性的子代小鼠（Gli1-creE

9、RT；Nse-Bmp4）或者（CD133-creERT；Nse-bmp4），進而與報告小鼠Zsgreen雜交，從而得到三重轉(zhuǎn)基因小鼠模型（Gli1-cre；Nse-Bmp4；Zsgreen）。簡單來說，Zsgreen報告小鼠，在cre重組酶的作用下，能夠?qū)sgreen前面的Stop基因盒子敲除，從而表達Zsgreen，發(fā)綠色熒光。所以在三重轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，我們可以直觀地通過觀察熒光來追蹤Gli1或者CD133在異位骨化中的分布情況。

10、
　　2.成年三重轉(zhuǎn)基因鼠（周齡大于一個月），按文獻方法(1)腹腔注射他莫昔芬（Tamoxifen）溶液，然后通過向肌肉注射心臟毒素（cardiotoxin）損傷肌肉，在損傷后1周，2周，4周（分別對應(yīng)著異位骨化早期，中期，后期）取相應(yīng)時相的小鼠處死，并取其目的組織，即損傷的左后肢。將目的組織（即異位骨區(qū)域以及對照組未損傷部位）放入4%多聚甲醛中固定，過夜。第二天，放入20%EDTA溶液中進行脫鈣一周，之后取組織進行冰凍切片，進行

11、組織化學(xué)分析。
　　3.免疫組化染色，確定Gli1-creERT或者CD133-creERT標記的細胞是否參與異位骨化的形成，另外通過與間充質(zhì)干細胞的表面分子標志物，內(nèi)皮細胞表面分子標志物，骨細胞表面分子標志物，軟骨細胞表面分子標志物進行共染來驗證其真實身份。首先取不同時相的切片，用胎牛血清封閉40min，加入一抗，過夜。第二天加二抗，核染色。用熒光顯微鏡觀察各個蛋白在組織中的表達情況。
　　【研究結(jié)果】
　　1. G

12、li1或者CD133標記的祖細胞在小鼠體內(nèi)皆有廣泛表達，其中Gli1標記的細胞大多數(shù)分布在間質(zhì)，且參與了正常長骨的形成；而CD133標記的細胞異質(zhì)性比較大。
　　2. Gli1標記的祖細胞在肌肉組織中包繞著血管，而CD133標記的細胞與血管關(guān)系并不緊密。
　　3. Gli1標記的祖細胞參與了各個階段異位骨化進程，而CD133標記的細胞在HO中幾無貢獻。
　　4.干細胞微環(huán)境參與調(diào)控HO的進程。
　　5.部分Gli

13、1-creERT標記的祖細胞表達間充質(zhì)干細胞的marker。Gli1-creERT標記的細胞在軟骨形成期表達SOX9，在成骨階段表達ALP，RUNX2。
　　6. Bmp-smad信號通路介導(dǎo)了HO的形成。
　　【結(jié)論】
　　1. Gli1標記的間充質(zhì)干細胞參與了異位骨化的形成，CD133+細胞則相反。
　　2.干細胞微環(huán)境參與調(diào)控HO的進程。
　　3. Bmp-Smad信號通路參與了損傷誘導(dǎo)的HO的形成。