基于代謝組學(xué)的4-壬基酚暴露與子宮肌瘤患病的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、4-壬基酚(4-NP)是一種典型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EDCs)，與雌激素依賴性的婦科腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系。4-NP廣泛存在于各種食品中，長期低劑量的膳食攝入是其主要的暴露形式。本研究應(yīng)用代謝組學(xué)方法篩選了長期低劑量4-NP暴露的生物標(biāo)志物，并通過對子宮肌瘤患者及對照人群的4-NP暴露標(biāo)志物檢測，結(jié)合受試者4-NP暴露的實際水平，研究了4-NP暴露與子宮肌瘤患病的關(guān)聯(lián)。研究內(nèi)容主要包括以下兩個部分:
　　一、4-壬基酚長期低劑量

2、暴露的代謝組學(xué)研究
　　SD雌性大鼠根據(jù)體重隨機分為暴露組(n=10)和對照組(n=10)，依據(jù)4-NP的每日可耐受攝入量(TDI:5.0μg/kg·bw/day)按照安全系數(shù)（人∶大鼠=1∶100）折算得4-NP暴露組大鼠染毒劑量(0.50mg/kg·bw/day)，對照組攝入等量賦型劑羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，所有大鼠均連續(xù)灌胃8周。在染毒第0天及第1、4、8周分別收集大鼠24小時尿液，尾靜脈取血液樣本，在第8周處死所有

3、大鼠并收集子宮及卵巢樣本。
　　尿液、血液和組織各樣本進行非靶標(biāo)代謝組學(xué)研究，即從全局分析的角度將樣本中所有的代謝物質(zhì)識別出來，全面尋找有差異的代謝物。上述樣本經(jīng)LC-Orbitrap-MS測定，獲得的數(shù)據(jù)經(jīng)在線處理，進一步通過偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)模型進行聚類分析和判別分析。所建的PLS-DA模型進一步通過置換檢驗驗證，結(jié)合R2和Q2數(shù)值我們得知所建各模型預(yù)測能力較好且沒有過擬合。PLS-DA模型顯示:尿液及血清

4、在暴露之前均無分離或聚類;隨著暴露周期的延長，暴露組和對照組逐漸分離，且顯著聚集，顯現(xiàn)出時間-效應(yīng)關(guān)系;子宮及卵巢組織亦能組間分離且聚集。以上結(jié)果初步驗證了4-NP暴露導(dǎo)致大鼠代謝譜的變化。結(jié)合各化合物時間-效應(yīng)關(guān)系及組間比較結(jié)果，我們篩選并確證了L-肉毒堿、L-乙酰肉毒堿、甲基丙二酰肉毒堿、羥基丁酸酰基肉毒堿、L-己酰肉毒堿、L-辛酰肉毒堿、癸基二酰二氯肉毒堿、十二烷酰肉毒堿、十四烷酰肉毒堿、胍乙酸和5-羥色胺等11個生物標(biāo)志物。這些

5、生物標(biāo)志物涉及脂肪酸β氧化及能量代謝、色氨酸和5-羥色胺代謝、鳥氨酸循環(huán)等代謝通路。
　　由非靶標(biāo)代謝組學(xué)研究結(jié)果可知，大鼠尿液、血清、子宮及卵巢四種樣本中均有肉毒堿類物質(zhì)檢出，且暴露組尿液及血清中肉毒堿類物質(zhì)水平均顯著高于對照組;其中以游離態(tài)左旋肉毒堿(C0)變化水平最為顯著。盡管子宮及卵巢組織臟器系數(shù)并無顯著變化，但結(jié)合大鼠肝臟臟器系數(shù)變化的結(jié)果，提示4-NP暴露下可能引發(fā)大鼠肝臟線粒體功能障礙，從而導(dǎo)致能量代謝受阻，引發(fā)肝臟

6、損傷。此外，暴露組大鼠血清雌二醇水平(16.80ng/L)低于對照組(17.82ng/L)，盡管差異沒有顯著性(P=0.079＞0.05)，但這也初步揭示了4-NP暴露引發(fā)的雌性生殖毒性;和對照組相比，暴露組大鼠出現(xiàn)子宮內(nèi)膜增生，并且有腎損傷，表現(xiàn)為:腎小管上皮細(xì)胞水腫、腎小球上皮細(xì)胞凋亡壞死及腎小球內(nèi)容物;對照組及暴露組的肝臟及卵巢未出現(xiàn)明顯差異。由上述結(jié)果我們得出初步結(jié)論:4-NP長期低劑量暴露具有一定的生殖毒性，而肉毒堿類物質(zhì)是4

7、-NP暴露的生物標(biāo)志物，亦可能作為4-NP暴露致雌性生殖毒性的潛在標(biāo)志物，需進一步進行靶標(biāo)代謝組學(xué)研究。
　　二、基于靶標(biāo)分析的4-壬基酚暴露與子宮肌瘤患病的關(guān)聯(lián)研究
　　分別利用正常組(n=44)，輕度宮頸炎患者(n=5)、中度宮頸炎患者(n=30)、重度宮頸炎患者(n=30)及病例組（子宮肌瘤患者n=46）人群尿液及血漿樣本，測定尿液中4-NP以獲得4-NP暴露水平，測定尿液和血漿8種肉毒堿類檢測以判斷4-NP暴露的生殖

8、毒性。針對尿液中4-NP建立的UPLC-MS/MS分析方法具有很好的靈敏度和精密度，方法檢出限(0.30ng/mL)、方法定量限(1.0ng/mL)能夠滿足實際測定需要，在一定濃度范圍內(nèi)線性良好(R2:0.9983)。在低中高(1.0、5.0、20.0ng/mL)三種濃度下，相對回收率(115.30％，99.34％，83.95％)良好。
　　針對八種肉毒堿類物質(zhì)建立的UPLC-MS/MS檢測方法亦準(zhǔn)確且穩(wěn)定，方法檢出限（尿液:0.

9、05-0.20ng/mL;血漿:0.10-0.30ng/mL）、方法定量限(尿液:0.15-0.60ng/mL;血漿:0.30-1.00ng/mL)能夠滿足實際測定需要，在一定濃度范圍內(nèi)線性良好（尿液R2:0.9980-0.9995;血漿R2:0.9972-0.9997）。在低中高(1.0、20.0、100.0ng/mL)三種濃度下，八種目標(biāo)物相對回收率（C0:80.21％-115.76％;C2:83.50％-109.47％;C6:99

10、.09％-109.09％;C8:100.33％-105.43％;C14:70.00％-89.58％;C16:89.74％-103.00％;C18:1:90.94％-106.52％;C18:2:88.95％-97.54％）良好。
　　根據(jù)測定結(jié)果，病例組4-NP水平顯著(P＜0.05)高于正常組及宮頸炎患者，但正常組和宮頸炎患者之間、輕度中度重度宮頸炎患者之間基本不存在顯著差異(P＞0.05);八種肉毒堿類物質(zhì)在各組人群血漿及尿液中

11、均有檢出，病例組血漿中游離肉毒堿(C0)水平顯著高于(P＜0.05)正常組及宮頸炎患者，但血漿酯?；舛緣A水平未顯現(xiàn)明顯規(guī)律;病例組尿液中游離態(tài)及酯酰肉毒堿水平均顯著升高(P＜0.05);正常組和宮頸炎患者之間、輕度中度重度宮頸炎患者之間亦沒有顯著差異(P＞0.05)。
　　由上述結(jié)果可知，各組間尿液中4-NP及肉毒堿水平變化基本一致——病例組4-NP水平及肉毒堿水平均高于正常組及宮頸炎患者，說明肉毒堿水平和4-NP水平有一定的關(guān)