核受體FXR上調(diào)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制蛋白表達(dá)及其分子機(jī)制的初步研究.pdf

1、研究背景：
　　 動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis， AS)是常見(jiàn)的心腦血管疾病， 體內(nèi)高密度脂蛋白High density lipoprotein， HDL)降低是 AS 形成的危險(xiǎn)因素之一。法尼酯 X 受體Farnesoid X receptor, FXR)是一種參與調(diào)控脂代謝的核受體，以鵝脫氧膽汁酸Chenodexycholicacid, CDCA)為最適天然配體，其基因敲除模型表現(xiàn)出HDL 清除率下降。FXR

2、在肝、小腸、腎上腺皮質(zhì)等組織細(xì)胞高表達(dá),而在血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中有少量表達(dá)。 FXR 可通過(guò)調(diào)控脂代謝相關(guān)基因，而影響血中HDL,LDL,TG的水平。脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制蛋白（Lipid transfer inhibitor protein，LTIP），又稱載脂蛋白F（apolipoproteinF, apo F),在血漿中主要存在于高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDL)中，少量存在低密度脂蛋白

3、中（Low density lipoprotein，LDL）,其生理作用是抑制膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Cholesterol ester transfer protein, CETP）介導(dǎo)的脂蛋白之間的膽固醇酯（Cholesterol ester, CE）和甘油三酯(triglyceride, TG)的交換。CETP 介導(dǎo)的這種脂質(zhì)交換可降低血中HDL的水平,故CETP的人工合成抑制劑被認(rèn)為有望成為治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物。LTIP作為天然存在

4、的蛋白質(zhì)分子，發(fā)揮抑制CETP 活性的作用，LTIP在AS 發(fā)生、發(fā)展中呈負(fù)相關(guān)。在所查國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中, 未見(jiàn)FXR 影響LTIP表達(dá)的報(bào)道。因此，本研究通過(guò)觀察 FXR 激動(dòng)劑對(duì) LTIP基因表達(dá)的影響及探討其調(diào)控機(jī)制，為FXR 調(diào)節(jié)LTIP及在脂代謝中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及為心腦血管疾病防治提供新的靶標(biāo)分子。
　　 研究目的：探討FXR對(duì)LTIP表達(dá)的影響及可能的分子調(diào)控機(jī)制研究方法：
　　 （1）FXR 激動(dòng)劑CDCA

5、和GW4064分別處理肝細(xì)胞系HepG2和L02，24小時(shí)后用RT-PCR和reAltime PCR 檢測(cè)LTIP基因Mrna水平的變化, Western Blotting 檢測(cè)LTIP基因蛋白水平的變化（2）生物信息學(xué)方法分析LTIP基因啟動(dòng)子序列，搜索FXR 可能的結(jié)合位點(diǎn)，分別構(gòu)建兩段含或不含預(yù)測(cè)的FXR 結(jié)合位點(diǎn)的序列，構(gòu)建到報(bào)告基因載體Pgl3-basic上，通過(guò)報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析LTIP 啟動(dòng)子序列的活性，進(jìn)而初步確定LTIP

6、 啟動(dòng)子區(qū)的FXR 結(jié)合位點(diǎn)所在范圍。隨后通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatinimmuno-precipitation,ChIP）分析培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)FXR與LTIP基因啟動(dòng)子序列FXR 結(jié)合位點(diǎn)的相互作用。
　　 （3）以雄性C57/BL6為動(dòng)物模型，隨機(jī)分為三組，以不同劑量的CDCA 灌胃處理7天，取肝臟組織提總RNA和總蛋白，RT-PCR和Western Blotting 法檢測(cè)LTIP Mrna和蛋白水平變化。
　　

7、 研究結(jié)果：
　　 （1）FXR 激動(dòng)劑CDCA和GW4064分別作用于 L02和HepG2細(xì)胞24 h，隨著濃度的增加(CDCA 0μmol/L，25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L；GW4064 0μmol/L，0.02μmol/L，0.2μmol/L，2 μmol/L)，與對(duì)照組相比，LTIP Mrna水平均顯著升高 (P<0.05)，蛋白水平均顯著升高（P<0.05），呈劑量依賴型。
　　 （

8、2）分析LTIP基因啟動(dòng)子區(qū)-3000bp 序列，得到可能的FXR 結(jié)合位點(diǎn)ER1，通過(guò)克隆含有ER1結(jié)合位點(diǎn)的長(zhǎng)序列（-3289～+22bp）和不含有ER1結(jié)合位點(diǎn)的短序列（-1872～+36bp），裝載到含有報(bào)告基因的質(zhì)粒Pgl3-basic，得到質(zhì)粒Pgl3-basic/ApoF(-3289～+22bp)和Pgl3-basic/ApoF（-1872～+36bp），瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染和報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明含有ER1結(jié)合位點(diǎn)的長(zhǎng)序列（-3289～

9、+22bp）具有明顯的激活轉(zhuǎn)錄活性，而不含有ER1結(jié)合位點(diǎn)的短序列（-1872～+36bp）不具備轉(zhuǎn)錄活性。HepG2細(xì)胞經(jīng)CDCA 處理后進(jìn)行ChIP 實(shí)驗(yàn)，加入抗FXR抗體的處理組擴(kuò)增出長(zhǎng)為196bp 包含LTIP 啟動(dòng)子區(qū)-2904bp 處ER1的序列（-2955～-2759bp），而陰性對(duì)照組未有明顯擴(kuò)增，（3）經(jīng)不同劑量CDCA 處理7天后C57BL/6小鼠肝臟組織的Mrna水平和蛋白水平明顯升高（P<0.05），呈劑量依賴型

10、。
　　 結(jié)論：
　　 （1）FXR 激動(dòng)劑CDCA和GW4064能顯著上調(diào)LTIP基因在HepG2和L02細(xì)胞中的Mrna和蛋白水平。
　　 （2）人LTIP 啟動(dòng)子區(qū)含有ER1結(jié)合位點(diǎn)的-3289～-1872bp的這段序列具有明顯的激活轉(zhuǎn)錄的活性。包含ER1結(jié)合位點(diǎn)的-2955～-2759bp 這段序列在HepG2細(xì)胞中能與FXR 結(jié)合，F(xiàn)XR 可能通過(guò)與ER1結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。
　　 （3）FX