MicroRNAs下調(diào)LXRs的分子機制及其對肝細胞脂質(zhì)生成的抑制作用研究.pdf

1、第一部分，非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfattyliverdisease,NAFLD)是肝功能異常最常見的一種誘因,以甘油三酯(Triglyceride,TG)在肝細胞中的堆積為特征。脂代謝的穩(wěn)態(tài)由一系列轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控,包括核受體中的肝X受體(liverXreceptors,LXRs)。LXRα(NR1H3)和LXRβ(NR1H2)是LXRs的兩種亞型,它們通過激活脂代謝相關(guān)基因而啟動肝臟脂質(zhì)生成,這些靶基因包括固醇調(diào)節(jié)

2、元件結(jié)合蛋白-1c(sterol-regulatoryelementbindingprotein1c,SREBP-1c)、脂肪酸合酶(fattyacidsynthase,FAS)、碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(carbohydrateresponsiveelement-bindingprotein,ChREBP)和乙酰CoA羧化酶(acetyl-CoAcarboxylase,ACC)。因此抑制LXRs的表達和活性就有可能保護肝臟免受脂肪堆

3、積所造成的損傷。MicroRNAs(miRs)是非編碼小RNA(20-22個核苷酸),能結(jié)合到靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'-untranslatedregion,3'-UTR),從而抑制基因的表達。在脂代謝的研究進展中,發(fā)現(xiàn)miRs在膽固醇和脂代謝的調(diào)控中發(fā)揮了重要作用。但是miRs是否能通過LXRs而影響肝臟脂質(zhì)生成還未見報道。
　　PartⅠMicroRNA-1/206/613下調(diào)LXRα的分子機制及其對肝細胞脂質(zhì)生成的

4、抑制作用研究
　　目的:
　　在人肝細胞系中,探討miR-1/206對LXRα的抑制作用,及這種作用可能存在的分子機制,并進一步揭示miR-1/206對LXRα誘導(dǎo)的脂質(zhì)生成的影響。此外,已有報道證明miR-613可以直接下調(diào)LXRα,因此本文主要集中于研究miR-613對LXRα誘導(dǎo)的脂質(zhì)生成的影響。
　　方法及結(jié)果:
　　1.在人肝細胞系中,經(jīng)Real-timePCR證實miR-1/206/613可抑制LXR

5、αmRNA的表達;經(jīng)過Westernblot證實miR-1/206/613可抑制LXRα蛋白的表達。對于miR-613,我們的實驗結(jié)果與先前的報道相一致。
　　2.我們經(jīng)過在線生物信息學(xué)預(yù)測(TargetScan和PicTar),發(fā)現(xiàn)在LXRαmRNA的3'-UTR上,miR-1/206/613存在相同的結(jié)合位點。經(jīng)Luc報告基因活性檢測證實miR-1/206/613可直接結(jié)合在LXRα3'-UTR中的預(yù)測結(jié)合位點。
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6、.經(jīng)Real-timePCR證實miR-1/206/613能夠抑制LXRα下游脂質(zhì)生成相關(guān)的靶基因(SREBP-1c、FAS、ChREBP和ACC1)的表達。這種抑制作用可以被LXRα表達質(zhì)粒pEX-LXRα(不帶3'-UTR)所拮抗,說明miR-1/206/613抑制脂質(zhì)生成相關(guān)基因是通過抑制LXRα實現(xiàn)的。
　　4.油紅O染色顯示miR-1/206/613能抑制肝細胞系中的脂滴堆積。這種抑制作用可以被LXRα表達質(zhì)粒pEX-L

7、XRα(不帶3'-UTR)所拮抗,說明miR-1/206/613抑制肝細胞系中的脂滴堆積是由LXRα介導(dǎo)的。
　　結(jié)論:
　　在人肝細胞系中,miR-1/206/613通過直接結(jié)合在LXRα的3'-UTR上而抑制LXRα的表達和活性,同時抑制LXRα介導(dǎo)脂質(zhì)生成。提示,“miR-1/206/613-LXRα”通路可能成為治療脂質(zhì)生成相關(guān)疾病的新靶點。
　　第二部分，PartⅡMicroRNA-7/18下調(diào)LXRβ的分子

8、機制研究
　　目的:
　　探討miR-7/18對LXRβ的抑制作用及其可能的分子機制。
　　方法及結(jié)果:
　　1.在人肝細胞系中,經(jīng)Real-timePCR證實miR-7/18可抑制LXRβmRNA的表達;經(jīng)過Westernblot證實miR-7/18可抑制LXRβ蛋白的表達。
　　2.經(jīng)Luc報告基因活性檢測證實miR-7/18可直接結(jié)合在LXRβ3'-UTR中的預(yù)測結(jié)合位點。
　　結(jié)論: