核受體FXR通過(guò)上調(diào)CISH和SOCS3表達(dá)而抑制肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)的研究.pdf

1、細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白(suppressor of cytokine signaling，SOCS)家族主要由CISH(cytokine inducible SH2-containing protein)和SOCS1-7等8個(gè)分子組成。SOCSs具有共同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，即由N端可變區(qū)、SH2區(qū)和C端的SOCS盒區(qū)組成。SOCS家庭可被多種因子誘導(dǎo)表達(dá)，并通過(guò)三種不同的方式對(duì)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的Janus激酶(Janus kinase，JAK)-

2、-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducers and activators oftranscription，STAT)信號(hào)通路進(jìn)行負(fù)反饋性調(diào)節(jié)：第一，通過(guò)其SH2結(jié)構(gòu)域與靶蛋白的磷酸酪氨酸殘基結(jié)合，使JAK的N末端失活；第二，阻止STAT與細(xì)胞因子受體位點(diǎn)的結(jié)合；第三，通過(guò)SOCS盒與elongin BC和泛素.蛋白酶體系統(tǒng)之間的相互作用促使靶蛋白發(fā)生蛋白酶體依賴途徑的降解。另外SOCS分子還可抑制活化蛋白1(activ

3、ation protein1，AP1)和核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)等促炎信號(hào)通路。因此，SOCS分子被認(rèn)為是一類重要的密切參與調(diào)控細(xì)胞因子一炎性信號(hào)通路的內(nèi)源性抗炎分子。并有文獻(xiàn)報(bào)道顯示在一些炎癥相關(guān)疾病中SOCS分子的過(guò)表達(dá)有助于控制炎癥反應(yīng)。因此，設(shè)法上調(diào)SOCSs的表達(dá)，將無(wú)疑有助于炎癥相關(guān)疾病的防治。近年來(lái)，有關(guān)核受體對(duì)SOCS分子的上調(diào)作用倍受關(guān)注，包括過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體

4、(PPAR)β/δ、PPARγ及雌激素受體(ER)等。
　　 法尼醇X受體(farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)為核受體超家族的重要成員，其配體主要包括內(nèi)源性配體CDCA和人工合成的特異性配體GW4064。除了密切參與調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝和具有的抗腫瘤功能外，近年發(fā)現(xiàn)，抗炎作用是FXR的一項(xiàng)重要的新功能，但關(guān)于其具體的抗炎機(jī)制還有待深入闡明。鑒于SOCS分子和FXR均具有重要抗炎功能，那么SOCS分子有無(wú)可能是FXR的新靶

5、基因，其表達(dá)是否可受到FXR的上調(diào)，目前尚不十分清楚。為了明確FXR對(duì)SOCS分子表達(dá)的調(diào)控作用及該調(diào)控在抗肝細(xì)胞炎癥中的作用，我們進(jìn)行了如下研究：
　　 1、SOCS家族分子在人肝細(xì)胞中有不同程度水平的表達(dá)
　　 采用RT-PCR證實(shí)SOCS家族分子在人肝癌細(xì)胞HepG2和人胎肝細(xì)胞L02中有不同程度水平的表達(dá)。
　　 2、FXR活化在人肝細(xì)胞和小鼠肝臟中可上調(diào)CISH和SOCS3的表達(dá)
　　 采用RT

6、-PCR、Real-time PCR和Western blot方法發(fā)現(xiàn)FXR激動(dòng)劑在人肝細(xì)胞(HepG2和L02)和小鼠肝臟中可上調(diào)SOCS家族分子CISH和SOCS3的表達(dá)，且呈劑量依賴性。
　　 3、FXR可增強(qiáng)人Cish和Socs3基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性
　　 采用真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，進(jìn)行人Cish和Socs3基因啟動(dòng)子重組報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明：在人肝細(xì)胞中，F(xiàn)XR激動(dòng)劑和組成性活化的外源性表達(dá)質(zhì)粒pCMX/v

7、pFXR可明顯增強(qiáng)Cish和Socs3基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析(http：//www.nubiscan.unibas.ch/)發(fā)現(xiàn)人Cish和Socs3基因的5’調(diào)控區(qū)可能存在FXR的結(jié)合位點(diǎn)。
　　 4、FXR在人肝細(xì)胞中抑制IL6所誘導(dǎo)的STAT5和STAT3的活化
　　 采用Western blot方法和RNAi策略證明在人肝細(xì)胞中，F(xiàn)XR激動(dòng)劑可以抑制IL6所誘導(dǎo)的STAT5的活化，且這種抑制作

8、用可能是通過(guò)上調(diào)CISH實(shí)現(xiàn)的。
　　 采用Western blot方法和RNAi策略證明在人肝細(xì)胞中，F(xiàn)XR激動(dòng)劑可以抑制IL6所誘導(dǎo)的STAT3的活化，且這種抑制作用可能與上調(diào)SOCS3的表達(dá)有關(guān)。
　　 5、FXR激動(dòng)劑CDCA可抑制LPS所誘導(dǎo)的小鼠肝臟細(xì)胞炎癥反應(yīng)
　　 以FXR激動(dòng)劑CDCA灌胃小鼠一周后腹腔注射LPS模擬急性肝炎模型。結(jié)果顯示CDCA預(yù)處理可抑制LPS所誘導(dǎo)的肝臟細(xì)胞炎癥反應(yīng)：①小鼠

9、肝臟組織切片HE染色顯示CDCA預(yù)處理可減少LPS所致的小鼠肝臟細(xì)胞損害(水腫、炎性浸潤(rùn)等)；②ALT、AST檢測(cè)顯示CDCA預(yù)處理可以降低LPS所致的肝功能損害；③Real-timePCR顯示CDCA預(yù)處理可以減少小鼠肝臟組織中LPS所誘導(dǎo)的促炎關(guān)鍵分子如IL6、TNFα、ICAM-1的mRNA水平，ELISA和Western blot方法顯示CDCA可以降低小鼠血清中IL6、TNFα的濃度和小鼠肝臟組織中ICAM-1的蛋白表達(dá)；④W

10、estern blot方法顯示CDCA可以抑制LPS所誘導(dǎo)的STAT5和STAT3的活化，且這種抑制效應(yīng)可能與上調(diào)CISH和SOCS3有關(guān)。
　　 總之，本研究結(jié)果顯示FXR可在人肝細(xì)胞和小鼠肝臟中誘導(dǎo)CISH和SOCS3的表達(dá)，并初步證實(shí)了這種上調(diào)作用是通過(guò)增強(qiáng)Cish和Socs3基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性而實(shí)現(xiàn)的。我們還通過(guò)RNAi策略證實(shí)FXR通過(guò)上調(diào)CISH和SOCS3抑制了STAT5和STAT3的活化。并且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示