ID2通過上調(diào)NOTCH3表達抑制乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化機制的研究.pdf

1、乳腺癌目前已成為女性發(fā)病率第一位的惡性腫瘤，其死亡率也已上升至第2位。原位乳腺癌并不致命，轉(zhuǎn)移并侵襲其它器官是其致死最重要的原因。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。ID2蛋白，（Inhibitor of DNA binding2，或Inhibitor of differentiation2）屬于HLH（Helix-Loop-Helix）蛋白分子家族一員，在

2、調(diào)節(jié)增殖分化、凋亡衰老、腫瘤形成等過程中有重要作用。ID2基因的缺失將導(dǎo)致乳腺腺泡上皮的分化的阻滯，多項研究表明ID2在小鼠乳腺上皮EMT模型中通過不同途徑抑制EMT的轉(zhuǎn)化過程，在人乳腺癌ID2也被報導(dǎo)與其侵襲性及EMT負相關(guān)關(guān)系。E2A蛋白由 tcf3基因編碼，經(jīng)不同剪切形成 E12和 E47兩個亞蛋白，屬 bHLH（basic Helix-Loop-Helix）蛋白家族成員之一，通常以同源二聚體形式作用于靶基因啟動子序列的E-box

3、結(jié)構(gòu)域在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮促進或抑制作用。E2A在生命的多個過程起重要作用，尤其在淋巴系統(tǒng)的發(fā)育中作用不可缺失，E2A對腫瘤的EMT過程作用的研究報導(dǎo)E2A有直接抑制E-ca表達促進EMT的作用，ID1/ID2/ID3則被報導(dǎo)有拮抗E2A的抑制E-ca轉(zhuǎn)錄的作用。NOTCH3蛋白屬NOTCH家族一員，其信號通路在維持干細胞干性、決定細胞命運、細胞分化、增殖、腫瘤形成及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程中起重要作用。有多篇文獻報導(dǎo)NOTCH3在多種腫瘤 EMT

4、轉(zhuǎn)化過程中的作用，本實驗室前期研究也已發(fā)現(xiàn) NOTCH3可通過上調(diào)GATA-3、ERα，抑制乳腺癌EMT的進展。因此我們推測ID2與NOTCH3也許在乳腺癌的EMT過程中存在相關(guān)關(guān)系并影響作用于乳腺癌EMT進展。在淋巴T細胞分化過程中有文章報導(dǎo)E2A與ID3共同在mRNA水平調(diào)控NOTCH1的表達精確調(diào)控著T細胞的分化發(fā)育，因此進一步我們推測E2A蛋白可能參與ID2與NOTCH3之間的調(diào)控機制?；谝陨涎芯勘尘?，我們推測在乳腺癌中ID2

5、與NOTCH3也許在乳腺癌的EMT過程中存在相關(guān)關(guān)系，且E2A在 mRNA水平參與一定的調(diào)控。本研究主要采用RNA干擾和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、免疫印跡、熒光定量PCR、染色質(zhì)免疫共沉淀、雙熒光素酶報告基因檢測、免疫共沉淀以及遷移和侵襲實驗等技術(shù)方法全面分析ID2、E2A與NOTCH3在乳腺癌上皮細胞的EMT中的作用及它們的調(diào)控關(guān)系。
　　首先我們利用五株乳腺癌細胞系檢測ID2及NOTCH3的表達。結(jié)果顯示：在ERα陽性表達的 MCF-7細胞中

6、 ID2與 NOTCH3的表達較高，而 ERα陰性表達細胞的MDA-MB-231、SKBR3細胞表達較低，這提示ID2與NOTCH3在乳腺癌細胞株表達存在一定的正相關(guān)性。
　　為了分析ID2與NOTCH3在乳腺癌EMT中的生物學(xué)意義，我們通過瞬時敲減id2的MCF-7細胞株，觀察到細胞的形態(tài)由上皮樣改變?yōu)殚g質(zhì)樣；同時構(gòu)建穩(wěn)定高表達 ID2的MDA-MB-231細胞株，觀察到細胞形態(tài)從間質(zhì)樣改變?yōu)樯掀?。遷移及侵襲實驗結(jié)果表明：瞬時

7、敲減id2的MCF-7細胞株的遷移、侵襲能力增強，而重新高表達NOTCH3后，其遷移、侵襲能力恢復(fù)。相反地，在穩(wěn)定高表達 ID2的MDA-MB-231細胞株其遷移、侵襲能力減弱，在此基礎(chǔ)上進一步敲減notch3，其遷移、侵襲能力恢復(fù)。這些功能實驗的結(jié)果表明ID2可能通過NOTCH3抑制乳腺癌細胞的EMT。
　　為了明確ID2與NOTCH3的關(guān)系，在分子水平，我們分別在沉默id2的MCF-7細胞株和高表達ID2的MDA-MB-231

8、細胞株中檢測NOTCH3及EMT相關(guān)因子的表達。結(jié)果顯示：1）在沉默內(nèi)源性id2的MCF-7細胞株中，NOTCH3、E-cad的mRNA及蛋白表達下調(diào)，Vimentin的mRNA及蛋白表達上調(diào)；2）高表達外源性ID2的MDA-MB-231細胞株， NOTCH3、E-cad的mRNA及蛋白表達上調(diào)，Vimentin的mRNA及蛋白表達下調(diào)。這些結(jié)果表明ID2正向調(diào)控NOTCH3的表達，并可上調(diào)E-cad表達下調(diào)Vimentin表達。

9、>　　進一步探討ID2調(diào)控NOTCH3的機制，我們考慮是否存在ID2與E2A共同調(diào)控Notch3啟動子轉(zhuǎn)錄活性，因此我們在MCF-7和MDA-MB-231細胞系中沉默內(nèi)源性tcf3及高表達外源性E12和E47檢測NOTCH3表達，并通過染色質(zhì)免疫共沉淀、雙熒光報告基因檢測和蛋白免疫共沉淀反應(yīng)來探討E2A與ID2在NOTCH3轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機制。結(jié)果顯示：1） E2A可負向調(diào)控NOTCH3在mRNA及蛋白水平表達；2）染色質(zhì)免疫沉淀實驗發(fā)

10、現(xiàn)E2A能直接結(jié)合到 notch3的啟動子區(qū)；3）雙熒光報告基因檢測證實 E2A負向調(diào)控 NOTCH3啟動子活性；4）免疫共沉淀反應(yīng)發(fā)現(xiàn)ID2可直接與E2A蛋白結(jié)合。這些結(jié)果表明E2A負向調(diào)控Notch3啟動子活性，而ID2可能通過直接與E2A形成異二聚體拮抗E2A作用。
　　綜上所述，本研究可以得出：ID2通過抑制E2A負性調(diào)節(jié)NOTCH3啟動子活性作用從而上調(diào)NOTCH3表達抑制乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)。該研究豐富了乳腺癌EMT調(diào)控理