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文檔簡介
1、股骨頭缺血性壞死(avascularnecrosisofthefemoralhead,ANFH)是臨床多發(fā)病和常見病,致殘率極高,多見于20-50歲青壯年,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和勞動能力,給社會和家庭造成巨大負(fù)擔(dān)。據(jù)世界衛(wèi)生組織不完全統(tǒng)計(jì),全世界約有3000萬人患有此病;我國患者約500-750萬,每年新發(fā)病例15-20萬,發(fā)病率呈逐年上升趨勢。ANFH目前尚無特效療法,已成為世界醫(yī)學(xué)界亟待攻克的難題。尋找新的有效的早期治療方法、保存
2、自身股骨頭顯得尤為重要,其潛在的社會和經(jīng)濟(jì)效益不言而喻。
不論何種病因引起的ANFH,其根本原因是存在骨內(nèi)壓升高→血供障礙這一惡性循環(huán)。一般認(rèn)為本病是一不可逆過程,因此,ANFH的治療策略應(yīng)該是早期治療,降低骨內(nèi)壓、改善股骨頭血供,打破惡性循環(huán),同時進(jìn)行壞死區(qū)骨質(zhì)修復(fù)。利用血管生長因子誘導(dǎo)新血管生成和側(cè)枝循環(huán)建立,是打破ANFH病理惡性循環(huán)最有效的手段,這也為ANFH治療提供了新的研究方向。
血管生長因子是一
3、組可以誘導(dǎo)血管生成的細(xì)胞因子。不同的血管生成因子具有不完全相同的生物學(xué)活性,因此,選擇何種血管生長因子至關(guān)重要。肝細(xì)胞生長因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)由間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生,具有很強(qiáng)的促血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascularendothelialcells,VECs)增殖和促血管生成作用,并可抑制細(xì)胞凋亡和減輕組織纖維化,已在治療缺血性心臟病和肢體動脈閉塞等疾病中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景,有望成為治療ANFH理想的血管生長因
4、子。
骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)是一種由骨髓中分離獲得的具有多種分化潛能的間質(zhì)干細(xì)胞,是體內(nèi)參與組織再生和修復(fù)的重要干細(xì)胞成分之一,取材方便,易于被外源基因轉(zhuǎn)染,同時還能分泌大量的促細(xì)胞和血管生長因子,其成分中含有骨祖細(xì)胞,具有良好的向成骨細(xì)胞分化的潛能。此外,BMSCs不具免疫原性,因此同種異體移植無免疫排斥反應(yīng),被認(rèn)為是骨組織工程近階段最有希望應(yīng)用于臨床的
5、種子細(xì)胞。目前,用BMSCs治療早期ANFH已顯示出誘人的應(yīng)用前景。
將基因治療和干細(xì)胞移植治療相結(jié)合,用HGF基因修飾BMSCs治療ANFH,比單用BMSCs具有明顯的優(yōu)勢,表現(xiàn)在:(1)BMSCs在發(fā)揮其成骨能力的同時分泌HGF,誘導(dǎo)新血管生成,改善股骨頭血供;(2)HGF對BMSCs有趨化作用,局部高分泌的HGF可使BMSCs“停留”在壞死區(qū)局部,利于其向成骨細(xì)胞分化;(3)HGF能抑制BMSCs凋亡,其誘生的血管可
6、改善移植細(xì)胞的生存環(huán)境,提高BMSCs移植存活率,進(jìn)而提高治療效果。
本課題將基因治療、干細(xì)胞移植、組織工程技術(shù)有機(jī)結(jié)合,以HGF為目的基因、以BMSCs為靶細(xì)胞,借助AdMax腺病毒載體系統(tǒng),將HGF基因轉(zhuǎn)入BMSCs;再以其為種子細(xì)胞,經(jīng)髓芯減壓隧道移植到股骨頭壞死區(qū),用于治療早期ANFH。在減壓的同時,移植細(xì)胞分泌的HGF誘導(dǎo)局部新血管生成和側(cè)枝循環(huán)建立,改善股骨頭血供;BMSCs在局部微環(huán)境誘導(dǎo)下向成骨細(xì)胞分化,修
7、復(fù)壞死區(qū)骨質(zhì),這種集減壓、血管生成和骨質(zhì)重建一體化的治療技術(shù),為ANFH治療提供了一種全新的模式。
目的:
在體外探討HGF調(diào)節(jié)BMSCs增殖與成骨分化活性的方式與機(jī)制的基礎(chǔ)上,評價HGF基因修飾BMSCs治療早期激素性和創(chuàng)傷性ANFH的療效,并初步探討發(fā)病與治療的分子機(jī)理。
方法:
1、分離培養(yǎng)與鑒定兔BMSCs
取4-8周齡健康新西蘭大白兔,麻醉后,于雙側(cè)髂后上棘
8、行穿刺法抽吸骨髓,抗凝處理后低速離心去上清,以10%FBS-低糖DMEM培養(yǎng)液重懸培養(yǎng),3d時換液去除未貼壁細(xì)胞,其后每3d換液1次;待細(xì)胞匯合成單層后消化,傳代細(xì)胞培養(yǎng)至第二代備用。
采用誘導(dǎo)培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞、成軟骨、脂肪細(xì)胞分化。培養(yǎng)12和24天后,磷酸苯二鈉基質(zhì)(NBT-BCIP)法染色和茜素紅(AR-S)染色以檢測成骨分化水平;培養(yǎng)27天后,阿利新藍(lán)染色以檢測成軟骨分化水平,油紅O染色以檢測成脂分
9、化水平;同時以qPCR法檢測BMSCs標(biāo)志基因Vimentin、成骨細(xì)胞標(biāo)志基因Runx2、成軟骨細(xì)胞標(biāo)志基因SOX9與脂肪細(xì)胞標(biāo)志基因PPAR-γ3mRNA的表達(dá)水平。
2、體外檢測HGF調(diào)節(jié)BMSCs增殖與分化活性的方式與機(jī)制
在成骨誘導(dǎo)環(huán)境中,以低濃度(20ng/mL)和高濃度(100ng/mL)的HGF處理BMSCs,EdU摻入法檢測細(xì)胞增殖,WST-8法檢測細(xì)胞活性;NBT-BCIP法行堿性磷酸酶(
10、Alkalinephosphatase,ALP)染色,AR-S法檢測鈣結(jié)節(jié)的形成。Western和qPCR檢測HGF受體c-Met、細(xì)胞分化開關(guān)分子——細(xì)胞周期抑制分子p27和成骨分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runx2與Osterix的表達(dá);以ERK信號通路特異性抑制劑PD98059(30μM)或Akt信號通路特異性抑制劑Wortmannin(100nM)預(yù)處理兔BMSCs1h,Western檢測信號通路活化水平及其對BMSCs增殖與分化的影響。<
11、br> 3、重組腺病毒Ad-HGF轉(zhuǎn)染兔BMSCs,檢測HGF的表達(dá)和活性
重組腺病毒Ad-HGF在293細(xì)胞中擴(kuò)增、氯化銫法超離純化,TCID50法測定感染性滴度,然后感染BMSCs,RT-PCR、原位雜交、免疫組化檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中HGF的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。
4、兔早期激素性ANFH造模與檢測
采用馬血清注射造成兔過敏性血管炎,再應(yīng)用大劑量腎上腺糖皮質(zhì)激素(醋酸潑尼松龍),誘導(dǎo)兔激素性ANFH
12、。4周后利用DR、CT、MRI、動脈墨汁灌注造影、病理切片HE染色、免疫組化等多種方法,觀察ANFH的影像及病理變化。
5、HGF基因修飾BMSCs治療兔早期激素性ANFH的研究
在CT引導(dǎo)下行髓芯減壓術(shù),將HGF基因修飾BMSCs經(jīng)減壓隧道移植入兔早期激素性ANFH模型壞死區(qū)。治療后4周,利用DR、CT、MRI、動脈墨汁灌注造影、病理切片HE染色、免疫組化等多種檢測手段評價療效,同時設(shè)置髓芯減壓組為對照。<
13、br> 為探討其機(jī)理,以腺病毒空載體轉(zhuǎn)染BMSCs和未轉(zhuǎn)染BMSCs為對照,術(shù)后4周,病理切片HE染色評價療效;術(shù)后2天、2周、4周取材,qPCR檢測p27、Runx2與OsterixmRNA的表達(dá),免疫組化檢測HGF、p-ERK1/2、p-Akt的表達(dá)。
6、兔早期創(chuàng)傷性ANFH造模與檢測
采用截斷股骨頸的方法造模:逐層切開表皮與肌肉,打開關(guān)節(jié)囊,切斷股骨頭周圍、含圓韌帶在內(nèi)的血管與韌帶,截斷股骨頸基
14、底部,使股骨頭斷端分離3-5min后復(fù)位,逐層縫合。術(shù)后3天、1周、2周、3周,利用CT、MRI、病理切片HE染色、免疫組化等多種方法,觀察ANFH的影像及病理變化。
7、HGF基因修飾BMSCs治療兔早期創(chuàng)傷性ANFH的研究
創(chuàng)傷后1周,在CT引導(dǎo)下行髓芯減壓術(shù),將HGF基因修飾BMSCs經(jīng)減壓隧道移植入兔早期創(chuàng)傷性ANFH模型壞死區(qū),然后用小夾板固定截斷股骨頸。術(shù)后4周,利用病理切片HE染色、免疫組化等手
15、段評價療效,同時設(shè)置腺病毒空載體轉(zhuǎn)染BMSCs和未轉(zhuǎn)染BMSCs為對照。
為探討其機(jī)理,術(shù)后2天、2周、4周取材,免疫組化檢測HGF、p-ERK1/2、p-Akt的表達(dá)。
8、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
所有計(jì)量資料結(jié)果用(x)±s表示。EdU法檢測信號通路抑制劑處理后BMSCs增殖、WST-8法檢測BMSCs活性、NBT-BCIP法檢測ALP活性、AR-S染色法檢測信號通路抑制劑處理后BMSCs鈣結(jié)節(jié)形成、q
16、PCR檢測成骨誘導(dǎo)環(huán)境中不同劑量HGF對c-Met、Osterix、Runx2與p27mRNA表達(dá)水平的長期影響、IHC檢測體內(nèi)HGF、p-ERK1/2與p-Akt表達(dá)水平采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析;EdU法檢測未施信號通路抑制劑處理的BMSCs增殖、AR-S染色法檢測鈣結(jié)節(jié)形成、骨髓細(xì)胞與股骨頭骨髓的面積比、空骨陷窩率、IHC檢測體內(nèi)vWF、CD105、PCNA、ColⅠ、OCN與VEGF的表達(dá)應(yīng)用單因素方差分析(One-WayANO
17、VA),方差不齊時用Welch校正,在差異顯著的前提下進(jìn)行多重比較,方差齊時采用LSD法,方差不齊時采用Dunnett'sT3法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,雙側(cè)檢驗(yàn)。采用SPSS16.0forwindows統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
結(jié)果:
1、成功培養(yǎng)出具有多向分化潛能的兔BMSCs
骨髓穿刺法分離、貼壁法純化成功培養(yǎng)出兔BMSCs,染色法與qPCR檢測證實(shí)兔BMSCs具有多向分化潛能,可分化為成骨
18、細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞與成脂細(xì)胞。
2、體外探討HGF調(diào)節(jié)BMSCs增殖與分化活性的方式與機(jī)制
①HGF體外調(diào)節(jié)BMSCs增殖與分化的活性
EdU摻入法與WST-8法檢測細(xì)胞增殖活性,NBT-BCIP法與AR-S法檢測細(xì)胞成骨分化。結(jié)果表明,100ng/mLHGF在成骨誘導(dǎo)環(huán)境中促進(jìn)BMSCs增殖而抑制其向成骨細(xì)胞分化,而20ng/mLHGF對BMSCs增殖有所抑制,但顯著促進(jìn)其向成骨細(xì)胞分化。
19、> ②機(jī)制研究1:不同劑量HGF對其受體c-Met的表達(dá)調(diào)控
20ng/mLHGF顯著提高c-Met的表達(dá)與活化水平,而100ng/mLHGF則部分抑制c-Met的表達(dá),且對c-Met的活化效應(yīng)明顯低于20ng/mLHGF。提示不同劑量HGF通過誘導(dǎo)其受體的不同表達(dá)與活化水平而產(chǎn)生不同的效應(yīng)。
③機(jī)制研究2:不同劑量HGF對ERK與Akt信號通路活化水平的影響
100ng/mLHGF通過活
20、化ERK通路、抑制Akt通路活化以顯著促進(jìn)BMSCs的增殖而抑制其成骨分化;20ng/mLHGF則抑制ERK通路、活化Akt通路,從而顯著促進(jìn)BMSCs的成骨分化,但對細(xì)胞增殖的促進(jìn)效應(yīng)低于100ng/mLHGF的作用效果。提示不同劑量HGF通過活化不同信號通路而產(chǎn)生不同效應(yīng)。
④機(jī)制研究3:不同劑量HGF對分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)調(diào)控
在成骨誘導(dǎo)環(huán)境中,20ng/mLHGF顯著促進(jìn)BMSCs中p27的表達(dá),并
21、通過提高Osterix與Runx2的表達(dá)以促進(jìn)BMSCs的成骨分化;而100ng/mLHGF對p27的表達(dá)具有抑制效應(yīng),成骨分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)也受到抑制。提示不同劑量HGF通過調(diào)控p27、Osterix與Runx2的表達(dá)而產(chǎn)生不同的效應(yīng)。
3、Ad-HGF轉(zhuǎn)染的BMSCs表達(dá)高水平HGF
Ad-HGF感染性滴度為2.6×1010TCID50/mL。轉(zhuǎn)染后的BMSCs在mRNA和蛋白水平均有HGF表達(dá)。
22、r> 4、成功建立兔早期激素性ANFH模型
DR、CT、MRI、動脈墨汁灌注造影、病理切片HE染色檢測結(jié)果表明,激素注射后4周,成功制備出兔早期激素性ANFH模型。免疫組化檢測新生血管指標(biāo)-CD105和組織修復(fù)指標(biāo)-Ⅰ型膠原(ColⅠ),結(jié)果提示:激素造模后,股骨頭血管生成受抑,成骨反應(yīng)逐漸減弱,無自身修復(fù)現(xiàn)象,4周發(fā)展為早期激素性ANFH。
5、HGF基因修飾BMSCs治療兔早期激素性ANFH的研究<
23、br> ①療效評價:
影像學(xué)和病理組織學(xué)檢查結(jié)果表明,治療組可顯著促進(jìn)壞死區(qū)血管再生和骨質(zhì)重建,DR顯示治療側(cè)股骨頭骨紋理較清楚;CT示點(diǎn)狀低密度影數(shù)量減少;MRI示點(diǎn)線狀高信號影不明顯;動脈墨汁灌注造影顯示軟骨下血管重建,干骺端大血管恢復(fù);病理切片HE染色結(jié)果顯示骨小梁排列基本規(guī)則,骨基質(zhì)量增多,空骨陷窩少,骨小梁骨板上可見新生毛細(xì)血管,邊緣有大量成骨細(xì)胞,骨髓中造血組織基本恢復(fù)。
⑦體內(nèi)實(shí)驗(yàn)機(jī)理研究
24、:
HGF基因修飾BMSCs治療組p27、Runx2與Osterix的表達(dá)水平最高,表達(dá)高峰在移植后2周。HGF的表達(dá)水平在ANFH模型組中顯著降低,但在HGF基因修飾BMSCs治療組中達(dá)到最高峰,表達(dá)高峰出現(xiàn)在移植后2天,ERK1/2信號通路活化水平隨之增加,之后二者表達(dá)水平逐漸降低。2周后p-Akt的水平逐漸增高,表達(dá)峰值出現(xiàn)在移植后4周。上述結(jié)果表明,HGF基因修飾BMSCs的HGF表達(dá)水平具有與體外相同的變化趨勢,
25、并通過與體外相同的機(jī)制,即由腺病毒載體介導(dǎo)的HGF體內(nèi)濃度的有序改變來調(diào)控BMSCs增殖與分化,發(fā)揮促組織修復(fù)與再生的功能。
6、成功建立兔早期創(chuàng)傷性ANFH模型
影像學(xué)與病理組織學(xué)檢查結(jié)果表明,術(shù)后3周,成功制備出處于臨床ARCOⅠ-Ⅱ期的兔早期創(chuàng)傷性ANFH模型。病理組織學(xué)檢查可見骨組織與血管系統(tǒng)發(fā)生明顯的壞死病變,同時,創(chuàng)傷后2周內(nèi)可見明顯的組織自我修復(fù)。CD105、ColI、OCN和PCNA免疫組化檢
26、測結(jié)果顯示,手術(shù)截斷股骨頸后,股骨頭血管生成受抑,組織損傷顯著,術(shù)后3天有一定程度的自身修復(fù),之后由于血運(yùn)阻斷,修復(fù)失敗,3周發(fā)展為早期創(chuàng)傷性ANFH。
7、HGF基因修飾BMSCs治療兔早期創(chuàng)傷性ANFH的研究
病理組織學(xué)檢查結(jié)果表明,HGF基因修飾BMSCs可顯著促進(jìn)創(chuàng)傷組織的恢復(fù),免疫組化檢測到ColI的表達(dá)模式與未治療組相反,提示成骨細(xì)胞活性增加,同時在治療組動物中VEGF與CD105表達(dá)上調(diào),提示新
27、生血管的發(fā)生,進(jìn)一步證實(shí)了BMSCs的療效。HGF在其中以類似于在激素性ANFH中的機(jī)制對BMSCs活性進(jìn)行調(diào)節(jié),從而促進(jìn)其修復(fù)創(chuàng)傷組織的功能。
結(jié)論:
1、獲得高表達(dá)人HGF基因的BMSCs,為其用于早期ANFH的治療奠定基礎(chǔ)。
2、成功誘導(dǎo)了兔早期激素性和創(chuàng)傷性ANFH模型,為進(jìn)一步研究其發(fā)病機(jī)理、發(fā)展新的有效的早期治療方法提供了基礎(chǔ),為將來評估新療法的療效提供了適宜的平臺。
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