拮抗高遷移率族蛋白B1對燙傷小鼠白介素-35表達(dá)及T細(xì)胞免疫功能的影響.pdf

1、嚴(yán)重?zé)齻笠壮霈F(xiàn)免疫功能紊亂，既往研究證實高遷移率族蛋白B1及白介素35在多原因?qū)е碌拿庖吖δ芪蓙y發(fā)病機(jī)制中起重要作用。
　　高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是燒傷后重要的晚期炎癥介質(zhì)和經(jīng)典的損傷相關(guān)分子(DAMPs)。HMGB1一方面參與炎性細(xì)胞的聚集和組織的修復(fù)，另一方面也能激活免疫功能細(xì)胞分泌TNF、IL-1和其它促炎因子，并引起血管通透性增加、發(fā)熱等病理生理反應(yīng)。此外HMGB1還能促使T細(xì)胞亞群分化由Th1向Th2漂移，并

2、可以促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)表面分子的成熟。既往研究發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重?zé)齻笾饕M織HMGB1表達(dá)廣泛、增高較晚，且持續(xù)時間長。臨床資料顯示，嚴(yán)重?zé)齻?天患者血漿HMGB1含量明顯升高，并且其水平與嚴(yán)重膿毒癥病理過程密切相關(guān)。因此HMGB1在燒創(chuàng)傷、感染、膿毒癥等病理生理過程中扮演著重要角色，被認(rèn)為是燒創(chuàng)傷引起膿毒癥的潛在治療靶點。
　　嚴(yán)重燙傷動物血清中的HMGB1表達(dá)水平升高，與脾臟Treg表面標(biāo)志分子表達(dá)上調(diào)、免疫抑制功能增強(qiáng)

3、有關(guān)。白介素35（IL-35）作為與Treg免疫抑制功能密切相關(guān)的新型細(xì)胞因子，在Treg的分化和發(fā)育中都不可或缺。IL-35由IL-12α（即p35）和EBI3兩個亞基構(gòu)成，在Treg的亞群(iTr35)、調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(Breg)、CD8陽性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD8+ Tregs)、髓源性免疫抑制細(xì)胞(MDSC)等免疫細(xì)胞表達(dá)。Treg可通過IL-35調(diào)控Th1、Th2和Th17等效應(yīng)T細(xì)胞的分化，如IL-35可將T細(xì)胞中Th1細(xì)胞周期阻

4、滯于G1期以抑制Th1增殖，或可通過抑制Th17表面受體表達(dá)，抑制Th17功能，從而相對增強(qiáng)Th2的功能。
　　嚴(yán)重燙傷后HMGB1是否會影響效應(yīng)細(xì)胞對IL-35的表達(dá)，繼而影響T淋巴細(xì)胞分化及免疫功能，尚未見文獻(xiàn)報道。
　　本實驗通過建立小鼠燙傷模型。采用實時熒光定量核酸擴(kuò)增檢測系統(tǒng)(Q-PCR)和酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)等動態(tài)檢測了小鼠燙傷后72 h內(nèi)其心、肝、脾、肺組織及脾臟單個核細(xì)胞中HMGB1和IL-35的

5、表達(dá)以及脾臟淋巴細(xì)胞功能的變化。通過腹腔注射HMGB1的特異性拮抗劑Abox拮抗小鼠體內(nèi)HMGB1的主動分泌和被動釋放，進(jìn)一步檢測此條件下，實驗小鼠體內(nèi)各臟器組織IL-35表達(dá)變化及脾臟淋巴細(xì)胞功能的改變。試圖了解小鼠燙傷后HMGB1對其臟器組織IL-35的表達(dá)及脾臟淋巴細(xì)胞功能變化的影響，為改善嚴(yán)重?zé)齻髾C(jī)體免疫抑制狀態(tài)提供新的思路。
　　目的:
　　觀察小鼠燙傷后心、肝、脾、肺組織及脾臟單個核細(xì)胞中HMGB1和IL-35

6、的表達(dá)變化，并探討HMGB1對臟器組織細(xì)胞表達(dá)IL-35及脾臟T淋巴細(xì)胞免疫功能的影響。
　　方法:
　　選擇成年、雄性BALB/c小鼠，稱重后隨機(jī)分為:空白組、假傷組、燙傷組、Abox干預(yù)組。乙醚吸入性麻醉后常規(guī)制作小鼠背部15％ TBSA燙傷模型。燙傷組和干預(yù)組小鼠燙傷后0、12h給予補(bǔ)液抗休克。干預(yù)組燙傷后2h和12h分別給予HMGB1特異性拮抗劑Abox腹腔注射（300μg/只）。于傷后24、48、72 h取材，留取

7、心、肝、脾、肺等組織，組織勻漿后，分別提取RNA和組織總蛋白;qPCR法測定IL-35亞基p35和EBI3 mRNA表達(dá)，ELISA法測定各組織、脾臟單個核細(xì)胞中HMGB1和IL-35蛋白表達(dá)。另將脾臟組織分離出脾臟單個核細(xì)胞，并用貼壁法分離部分脾臟單個核細(xì)胞中的T細(xì)胞，cck8法檢測T細(xì)胞增殖活性;并取T細(xì)胞上清測定IL-2、IFN-γ、IL-4含量。
　　使用SPSS16.0軟件對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（

8、(x)±s）表示;資料滿足正態(tài)分布時，采用兩獨立樣本t檢驗;組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、小鼠燙傷后臟器組織HMGB1及IL-35表達(dá)變化
　　正常小鼠（空白組）心、肝、脾、肺組織及脾臟單個核細(xì)胞HMGB1蛋白和IL-35亞基（P35及EBI3）mRNA和蛋白表達(dá)均有表達(dá)。與空白組比較，假傷組肝、脾、肺組織及脾臟單個核細(xì)胞HMGB1蛋白表達(dá)無差異(P＞0.05)，而假

9、傷組心臟組織HMGB1蛋白表達(dá)高于空白組(P＜0.05);假傷組心、肝、脾組織及脾臟單個核細(xì)胞于48 h內(nèi)P35及EBI3 mRNA水平高于空白組(P＜0.05)，肺組織P35及EBI3 mRNA無明顯差異(P＞0.05);假傷組肝、脾、肺組織及脾臟單個核細(xì)胞于72內(nèi)IL-35蛋白表達(dá)與空白組無差異，心臟組織IL-35蛋白表達(dá)高于空白組(P＜0.05)。與空白組與假傷組比較，燙傷組傷后24、48、72 h小鼠心、肝、脾臟組織中HMGB1

10、蛋白、P35、EBI3 mRNA及IL-35蛋白水平明顯升高(P＜0.01)，而肺臟組織中P35、EBI3 mRNA及IL-35蛋白水平明顯下降。
　　2、Abox干預(yù)對燙傷小鼠組織HMGB1表達(dá)的影響
　　與假傷組與空白組比較，燙傷組各臟器HMGB1表達(dá)在燙傷后24h顯著上升(P＜0.01)，并在24～48h維持在高水平，燙傷72h后逐漸下降。與燙傷組比較，Abox干預(yù)組傷后24、48 h小鼠心、肝、脾、肺組織HMGB1含

11、量及脾臟單個核細(xì)胞HMGB1表達(dá)均明顯下降(P＜0.01)。
　　3、Abox干預(yù)對燙傷小鼠體內(nèi)IL-35表達(dá)水平的影響
　　3.1 IL-35 mRNA表達(dá):
　　與假傷組比較，燙傷組小鼠各臟器IL-35亞基p35mRNA表達(dá)均明顯提高。其中以脾臟變化最明顯，肺臟變化最小，在傷后48h、72h，肺臟p35mRNA表達(dá)水平與假傷組無差異。亞基EBI3 mRNA表達(dá)水平均升高(P＜0.05)以肝臟變化最大，肺臟變化最小，

12、在傷后48h與72h組，肺臟EBI3mRNA表達(dá)水平與假傷組無差異。使用Abox干預(yù)后24h，燙傷小鼠各臟器中IL-35兩亞基的表達(dá)水平均明顯下調(diào)(P＜0.01)。干預(yù)后48h，肺臟兩亞基mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.2 IL-35蛋白水平變化:
　　與假傷組比較，燙傷后24h心臟、肝臟、脾臟組織中IL-35蛋白含量及脾臟單個核細(xì)胞IL-35的分泌量均較假傷組升高(P＜0.01)，以脾臟變化最大。而燙傷后24h

13、肺組織IL-35蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)下降(P＜0.01)。Abox干預(yù)后小鼠心臟、肝臟、脾臟組織和脾臟單個核細(xì)胞IL-35蛋白水平均明顯下降(P＜0.01)。肺組織IL-35變化趨勢與其它組織相反，Abox干預(yù)后其含量明顯上升。
　　4、Abox干預(yù)對燙傷小鼠脾臟T細(xì)胞免疫功能的影響
　　4.1 IFN-γ及IL-4分泌水平:
　　與假傷組比較，燙傷組T淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ及IL-4含量于傷后24、48 h明顯升高(P

14、＜0.01)，72 h降低至假傷組水平(P＞0.05)。與燙傷組比較，Abox干預(yù)后，傷后24、48 h IFN-γ更明顯升高，IL-4明顯降低，因此Abox干預(yù)組IFN-γ/IL-4比值較燙傷組明顯升高(P＜0.01)。
　　4.2 T淋巴細(xì)胞增殖活性:
　　與假傷組比較，燙傷組的T淋巴細(xì)胞增殖活性及其細(xì)胞因子IL-2含量顯著降低。Abox干預(yù)后，T細(xì)胞增殖活性，T淋巴細(xì)胞增殖活性及其細(xì)胞因子IL-2含量較燙傷組顯著升高(

15、P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　正常小鼠心、肝、脾、肺組織及脾臟單個核細(xì)胞HMGB1蛋白和IL-35亞基（P35及EBI3）mRNA和蛋白表達(dá)均有表達(dá)。小鼠燙傷后，心、肝、脾組織中IL-35亞基（P35及EBI3）mRNA表達(dá)水平及IL-35蛋白水平明顯升高，而肺組織中P35及EBI3 mRNA及IL-35蛋白水平明顯下降。Abox可有效的降低燙傷小鼠心、肝臟、脾組織及脾臟單個核細(xì)胞對HMGB1、P35和EBI3 mRNA