ERα及miR-30e通過(guò)調(diào)控MTA1降低EMT發(fā)生潛能抑制肝癌侵襲與轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究.pdf

1、肝細(xì)胞肝癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）是危害我國(guó)人民健康的重大疾病之一，其發(fā)病率列全球惡性腫瘤第六位，死亡率列第三位。HCC是一種血管豐富的腫瘤，相對(duì)于其他實(shí)體腫瘤而言，其早期發(fā)現(xiàn)比較困難，確診時(shí)高達(dá)90％以上的患者已屬中、晚期。值得關(guān)注的是，HCC具有高轉(zhuǎn)移性和侵襲性的特征，特別是肝內(nèi)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及頻繁的術(shù)后復(fù)發(fā)，是導(dǎo)致其高死亡率的主要原因。為了提高早期診斷和改善預(yù)后，迫切需要進(jìn)一步探究促進(jìn)HCC發(fā)展和

2、發(fā)生早期轉(zhuǎn)移的詳細(xì)機(jī)制。同時(shí)，大量的臨床病例資料顯示HCC的發(fā)生及進(jìn)展還表現(xiàn)出顯著的性別差異。逐漸得到的共識(shí)是雌激素在HCC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著十分重要的作用，但是，相比于其他性激素敏感器官，雌激素在肝癌中作用的研究相對(duì)較少，特別是對(duì)分子機(jī)理的探討明顯不足。因此，本研究以大量人體慢性肝炎及肝細(xì)胞癌標(biāo)本為基礎(chǔ)，結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物模型，系統(tǒng)研究了ERα及miR-30e在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用及其分子機(jī)制，獲得以下主要結(jié)果:
　　1.

3、基于大量人類肝細(xì)胞肝癌臨床標(biāo)本，利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)和免疫組織化學(xué)的方法以人正常肝組織為對(duì)照，分別檢測(cè)肝癌切除術(shù)后所得的腫瘤組織及相應(yīng)的癌旁組織中轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(metastasis-associated gene1，MTA1)的表達(dá)水平，通過(guò)Kaplan-Meier曲線研究不同MTA1表達(dá)水平與HCC患者生存率及復(fù)發(fā)率之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn):MTA1在肝癌組織及癌旁肝硬化組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)明顯高于正常組織(P＜0.01)，同時(shí)，M

4、TA1蛋白在肝癌組織及癌旁肝硬化組織中的表達(dá)也明顯高于正常組織(P＜0.01)。通過(guò)Kaplan-Meier曲線及Log-rank檢驗(yàn)證明MTA1能夠影響腫瘤的復(fù)發(fā)及患者的生存期。本研究通過(guò)對(duì)以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析提示，MTA1可以作為判斷肝癌肝切除術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)及患者生存率預(yù)測(cè)的指標(biāo)。
　　2.肝癌發(fā)病性別差異一直是國(guó)際肝癌學(xué)術(shù)界研究熱點(diǎn)，基于大量人類肝癌標(biāo)本，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot的方法檢測(cè)MTA1基因的表

5、達(dá)水平;運(yùn)用Edu摻入和Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)分別就MTA1對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響進(jìn)行評(píng)估;并利用shRNA技術(shù)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)來(lái)研究細(xì)胞系中ERα對(duì)MTA1的調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MTA1在男性HCC及癌旁組織中較正常肝組織顯著性地高表達(dá)，然而，在女性患者標(biāo)本中沒(méi)有類似發(fā)現(xiàn)。并且與正常肝組織比較，ERα在男性腫瘤和癌旁組織中表達(dá)顯著地降低，男性腫瘤及癌旁組織中MTA1增加量與ERα減少量呈線性相關(guān)。通過(guò)體外細(xì)胞模

6、型及啟動(dòng)子活性分析表明，MTA1啟動(dòng)子上有3個(gè)功能性雌激素受體結(jié)合元件（ERE）的半結(jié)合位點(diǎn)，雌激素(E2)能夠結(jié)合ERα從轉(zhuǎn)錄水平抑制肝癌細(xì)胞中MTA1的表達(dá)。過(guò)表達(dá)ERα可抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力;另一方面，過(guò)表達(dá)MTA1可以減弱ERα介導(dǎo)的對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用以及其在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)腫瘤形成的抑制作用。這表明，ERα和MTA1之間存在反饋調(diào)節(jié)關(guān)系?？傊?，的結(jié)果表明，ERα通過(guò)下調(diào)MTA1基因的轉(zhuǎn)錄，抑制了人肝癌細(xì)胞的增

7、殖和侵襲能力。因此，通過(guò)本研究闡明了另一條可用于解釋肝癌發(fā)病性別差異性的通路:男性肝癌及癌旁組織中ERα下調(diào)，從而使處于肝硬化和癌變?cè)缙诘母渭?xì)胞失去雌激素的保護(hù)作用，并導(dǎo)致MTA1高表達(dá)，最終通過(guò)其下游信號(hào)通路激活導(dǎo)致肝癌的在男性中高發(fā)。
　　3.已知MTA1是一個(gè)典型的轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白，它在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)發(fā)生的過(guò)程中是至關(guān)重要的，然而，涉及其上、下游調(diào)控機(jī)制的相關(guān)知識(shí)還知之甚少。本研究中，致力于探討在人類肝細(xì)胞癌(HCC)

8、中MTA1上游的調(diào)控因子和其下游的效應(yīng)靶點(diǎn)以及其作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)中采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)和免疫組化的方法檢測(cè)不同基因的表達(dá)水平，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和生物信息學(xué)方法來(lái)預(yù)測(cè)它們之間潛在的相關(guān)性和調(diào)控關(guān)系，并進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證上述調(diào)控關(guān)系。研究納入了總共94對(duì)HCC腫瘤和癌旁組織樣本，檢測(cè)結(jié)果表明，在人類HCC中，miR-30e的減少與MTA1的增加相關(guān)聯(lián)，miR-30e可以結(jié)合在MTA1基因的3'端非翻譯區(qū)(3'UTR)從而在轉(zhuǎn)

9、錄后水平調(diào)控MTA1的表達(dá)，并與EMT的發(fā)生負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步的，在人類HCC中，MTA1的顯著高表達(dá)與ErbB2的過(guò)表達(dá)相關(guān)聯(lián)，MTA1可與組蛋白去乙?；?HDAC2)結(jié)合形成復(fù)合物作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)ErbB2的轉(zhuǎn)錄。MTA1促進(jìn)EMT發(fā)生的效應(yīng)很大程度上依賴于ErbB2，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均表明或是沉默或是抑制了ErbB2的活性，可以顯著地減弱由過(guò)表達(dá)MTA1所介導(dǎo)的EMT的發(fā)生?？傊?，的研究表明，在人類HCC中miR-30e的下調(diào)可以

10、增加MTA1的表達(dá)，并進(jìn)一步地通過(guò)增加ErbB2的表達(dá)促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　綜上所述，通過(guò)研究表明，MTA1不僅參與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展，而且與其術(shù)后復(fù)發(fā)、預(yù)后不良以及低生存率等臨床特征密切相關(guān)。一方面，ERα在男性肝癌及癌旁組織中下調(diào)，通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，導(dǎo)致MTA1高表達(dá)，有利于增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，影響肝癌惡性程度及轉(zhuǎn)移潛能等生物學(xué)特性;另一方面，在人類HCC中下調(diào)的miR-30e也可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控MT