先天性腸無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥病因和發(fā)病基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分先天性腸無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥神經(jīng)標(biāo)志物的表達(dá)特點(diǎn)小結(jié)
　　目的：研究 BMP2、BMP4、Ret、CXCR4、CR、GDNF、NSE、S-100、CAD、Bcl-2等幾種神經(jīng)節(jié)細(xì)胞標(biāo)志物在先天性無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥(HSCR)的表達(dá)特點(diǎn)，并探討它們與先天性無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥(HSCR)的病因相關(guān)性及臨床診斷意義。
　　方法：采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè) BMP2、BMP4、Ret、CXCR4、CR、GDNF、NSE、S-100、CAD、B

2、cl-2等幾種神經(jīng)標(biāo)志物在45例HSCR(HSCR正常段、擴(kuò)張段組、痙攣段組)、10例先天性巨結(jié)腸類源?。℉AD）和10例對(duì)照組結(jié)腸壁的表達(dá)，并與常規(guī)HE染色進(jìn)行對(duì)比分析。
　　結(jié)果：HE染色擴(kuò)張段腸壁神經(jīng)叢中可見(jiàn)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，痙攣段神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失；所有標(biāo)志物的免疫組織化學(xué)染色與 HE染色診斷結(jié)果一致。50％～70%的病例陽(yáng)性表達(dá) BMP2、BMP4、Ret、CXCR4、GDNF等，90%以上病例表達(dá)CR、NSE、S-100、CAD

3、等陽(yáng)性，Bcl-2在正常對(duì)照組和發(fā)育較好的HSCR病例中不表達(dá)，在新生兒HSCR和巨結(jié)腸類緣病中表達(dá)陽(yáng)性。
　　結(jié)論：1）GDNF、BMP2、BMP4、Ret、CXCR4等標(biāo)志物通過(guò)激活不同的信號(hào)途徑參與腸神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，與部分 HSCR的病因有關(guān)；2）Bcl-2只在發(fā)育不成熟的神經(jīng)嵴細(xì)胞表達(dá),可用于鑒別HSCR和HAD；3）CR、S-100和 CAD聯(lián)合免疫組化檢查對(duì)HSCR的臨床診斷價(jià)值較高，聯(lián)合運(yùn)用這些指標(biāo)，對(duì)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和神

4、經(jīng)纖維呈互補(bǔ)性陽(yáng)性顯色，可以增加診斷的準(zhǔn)確性。
　　第二部分兒童先天性腸無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥的基因芯片檢測(cè)及相關(guān)基因篩選
　　目的：研究先天性腸無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥患兒直結(jié)腸病變段(痙攣段)的全人類基因表達(dá)譜檢測(cè)方法及結(jié)果分析，初步篩查小兒先天性腸無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥的差異表達(dá)基因。
　　方法：應(yīng)用全基因表達(dá)譜芯片技術(shù)對(duì)6例先天性腸無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥患兒直結(jié)腸病變段(痙攣段)和3例正常結(jié)腸組織進(jìn)行全人類基因表達(dá)譜進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果所提供

5、的火山圖（Volcano Plots）、盒狀圖（ Box Plot）、散點(diǎn)圖（ Scatter Plot）、聚類圖（ Heat Map and Hierarchical Clustering）、P值（P-value）、絕對(duì)差異倍數(shù)（Absolute Fold change）等方法分析所得結(jié)果，初步篩選出對(duì)小兒先天性腸無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥有意義的差異表達(dá)基因，為下一步進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證及分析研究篩選出目標(biāo)基因。
　　結(jié)果：在檢測(cè)到的20000多

6、個(gè)人類基因中，初步篩選出上調(diào)的差異表達(dá)基因共3850個(gè)， P-value值均＜0.05，差異倍數(shù)均＞2倍， P-value值0.01~0.05共154個(gè)，0.001~0.009之間共468個(gè)，0.0001~0.0009之間共834個(gè)，P-value值＜0.0001共2394個(gè)基因；下調(diào)的差異表達(dá)基因共645個(gè)，P-value值均＜0.05，差異倍數(shù)均＞2倍， P值0.01~0.05共52個(gè)，0.001~0.009之間共111個(gè)，0.00

7、01~0.0009之間共142個(gè)，P-value值＜0.0001共321個(gè)基因。上調(diào)的與經(jīng)典信號(hào)通道有關(guān)的基因共118個(gè)， P-value值＜0.01，0.01～0.0001共48個(gè)，差異倍數(shù)均＞2倍；P-value值＜0.0001共70個(gè)，差異倍數(shù)均＞2倍；下調(diào)的與經(jīng)典信號(hào)通道有關(guān)的基因共11個(gè)， P-value值均＜0.001，差異倍數(shù)均＞2倍。
　　結(jié)論：1)先天性腸無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥發(fā)生病因非常復(fù)雜，常涉及多基因改變。2)基因

8、表達(dá)譜芯片技術(shù)可同時(shí)產(chǎn)生大量的表達(dá)基因數(shù)據(jù)，利用多種技術(shù)對(duì)芯片產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，可為先天性腸無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥發(fā)病機(jī)理的研究提供一個(gè)全新的目標(biāo)和方向，是一種快捷高效的研究手段。
　　第三部分先天性腸無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥患兒結(jié)腸組織中WNT5a、GLI-1、BMP7的表達(dá)特點(diǎn)研究
　　目的：研究 WNT5a、GLI-1、BMP7在先天性腸無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥患兒正常段(吻合口)、擴(kuò)張段、痙攣段中的表達(dá)和分布特點(diǎn)，驗(yàn)證芯片結(jié)果，并與正

9、常結(jié)腸組織進(jìn)行比較，探討它們與先天性無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥(HSCR)的病因相關(guān)性及分子生物學(xué)意義。
　　方法：收集本院確診為先天性腸無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥的患兒手術(shù)時(shí)切除的結(jié)腸組織75例，外傷等非先天性腸無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥患兒的正常結(jié)腸組織10例；采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)WNT5a、GLI-1、BMP7在75例HSCR(正常段、擴(kuò)張段、痙攣段)和10例正常對(duì)照組的結(jié)腸壁的表達(dá)情況，并與常規(guī) HE染色進(jìn)行對(duì)比分析；Western blotting檢測(cè)

10、WNT5a、GLI-1、BMP7蛋白在先天性腸無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥患兒結(jié)腸組織不同部位的表達(dá)水平； qRT-PCR檢測(cè) WNT5amRNA、GLI-1mRNA、BMP7 mRNA在先天性腸無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥患兒結(jié)腸組織不同部位的表達(dá)水平；
　　結(jié)果：1）HE染色，正常結(jié)腸和先天性腸無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥的正常段、擴(kuò)張段腸壁神經(jīng)叢中可見(jiàn)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，而病變的痙攣段則神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失。
　　2）免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)顯示，在有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的正常結(jié)腸組織和

11、先天性腸無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥患兒結(jié)腸組織正常段、擴(kuò)張段，WNT5a、GLI-1、BMP7均有表達(dá)。在缺乏神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的痙攣段， WNT5a、GLI-1、BMP7無(wú)明顯表達(dá)。
　　3）Western blotting檢測(cè)顯示，先天性腸無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥結(jié)腸組織的痙攣段 WNT5a、GLI-1、BMP7蛋白表達(dá)水平顯著低于擴(kuò)張段和正常段（P﹤0.01，n=75）；
　　4）qRT-PCR檢測(cè)顯示，先天性腸無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥患兒結(jié)腸組織痙攣段 W

12、NT5amRNA、GLI-1mRNA、BMP7 mRNA顯著低于擴(kuò)張段和正常段（P﹤0.01，n=75），而擴(kuò)張段與正常段兩組間比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P﹥0.05，n=75）；
　　結(jié)論：
　　1）WNT5a、GLI-1、BMP7在先天性腸無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥患兒結(jié)腸組織的正常段和擴(kuò)張段中具有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的部位表達(dá)，在病變的痙攣段中由于缺乏神經(jīng)節(jié)細(xì)胞而表達(dá)水平顯著降低。
　　2）結(jié)果與基因芯片相吻合。
　　3）這種表達(dá)的

13、差異性可能與WNT5a、GLI-1、BMP7作為發(fā)育相關(guān)基因參與了先天性腸無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥的發(fā)病有關(guān)，具體的分子生物學(xué)機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。
　　第四部分跨胎盤(pán)RNAi技術(shù)研究WNT5A質(zhì)粒在小鼠腸無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥發(fā)生過(guò)程中的作用機(jī)制研究
　　目的：構(gòu)建表達(dá) WNT5a基因 RNA干擾片段的質(zhì)粒，在 Balb/C小鼠懷孕后不同時(shí)間窗（E8.5-E14.5）通過(guò)孕鼠尾靜脈注射一定量的RNAi質(zhì)粒下調(diào) WNT5a基因表達(dá)。研究 B

14、alb/C小鼠胚胎發(fā)育不同時(shí)期（E8.5-E14.5）WNT5a在腸道組織表達(dá)水平的變化特點(diǎn)和表達(dá)定位情況，探討 WNT5a對(duì)胎鼠消化道發(fā)育表現(xiàn)型的影響、在小鼠腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作用及其與先天性腸無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥發(fā)病的相關(guān)性。
　　方法：1）采用DNA重組技術(shù)將靶向的WNT5a基因的RNA干擾片段定向克隆到載體pcDNA6.2TM-GW/ EmGFP-miR(Life, Catalog no. K4936-00)上，構(gòu)建含有表達(dá)WN

15、T5a基因的質(zhì)粒,經(jīng)過(guò)擴(kuò)增、測(cè)序并驗(yàn)證；2)從胎腸開(kāi)始發(fā)育的孕第8.5天起，在不同的時(shí)間點(diǎn)、以不同的濃度、注射體積、注射速度（注射時(shí)間）通過(guò)尾靜脈向妊娠的Balb/C小鼠體內(nèi)注射WNT5a基因RNA干擾質(zhì)粒，下調(diào)WNT5a基因表達(dá)，獲得靶基因WNT5a表達(dá)水平下調(diào)的子鼠；3）取注射質(zhì)粒后48h胚胎和出生后2天小鼠處死，解剖取出整個(gè)消化道（從胃到直腸），分段（前腸、中腸、后腸）制備冰凍切片，免疫組化檢測(cè)WNT5s及其下游基因的表達(dá)情況及腸

16、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育情況，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況；利用qRT-PCR檢測(cè)WNT5s及其下游基因mRNA的表達(dá)情況；利用 Western-blot檢測(cè) WNT5s及其下游基因蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1）成功構(gòu)建表達(dá) WNT5a基因 RNA干擾片段的穿梭質(zhì)粒pcDNA6.2TM-WNT5a1、2、3、4以及陰性對(duì)照質(zhì)粒 pcDNA6.2TM-scrambled，測(cè)序驗(yàn)證得出重組克隆中插入的片段序列與設(shè)計(jì)的寡聚單鏈DNA序

17、列是一致的;2）妊娠Balb/C小鼠尾靜脈注射WNT5a質(zhì)粒后可以通過(guò)胎盤(pán)屏障，有效下調(diào) WNT5a基因在腸道組織表達(dá)；轉(zhuǎn)染效果受質(zhì)粒濃度、注射體積、注射速度（注射時(shí)間）以及孕鼠體重等影響；3）免疫組化檢測(cè)顯示干擾后子鼠后腸發(fā)育不良，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失；qRT-PCR結(jié)果顯示W(wǎng)NT5a mRNA在前腸和中腸的表達(dá)水平較后腸顯著增高；Western-blot結(jié)果顯示 WNT5a蛋白的表達(dá)情況與qRT-PCR結(jié)果相一致；4）WNT5a下調(diào)后的胎