P450表氧化酶-環(huán)氧二十碳三烯酸代謝通路在糖尿病皮膚創(chuàng)面難愈性潰瘍中的作用與調(diào)控機(jī)制探討.pdf

1、皮膚的難愈性潰瘍是糖尿病患者常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥，是糖尿病患者致殘、致死的重要因素，目前尚無(wú)有效的預(yù)防與治療措施。創(chuàng)面炎癥慢性遷延及血管再生障礙是其顯著病理特征，也是具有前景的治療靶點(diǎn)。環(huán)氧-二十碳三烯酸(EETs)是花生四烯酸細(xì)胞色素P450表氧化酶(CYP)的代謝產(chǎn)物，具有廣泛生物效應(yīng)，尤其對(duì)炎癥、血管再生等病生理過(guò)程具有重要調(diào)控作用。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病血管內(nèi)皮的CYP的表達(dá)量低于正常水平。糖尿病難愈性潰瘍的形成是否與CYP/EE

2、Ts代謝通路異常有關(guān)？目前尚不清楚。
　　目的:
　　本課題利用小鼠皮膚創(chuàng)面模型，比較分析糖尿病及非糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)面CYP代謝酶類(lèi)的表達(dá)差異及其與創(chuàng)面愈合指標(biāo)的相關(guān)性;觀察外源性EETs、EET拮抗劑對(duì)創(chuàng)面愈合的影響，以及對(duì)炎癥、血管再生相關(guān)指標(biāo)的影響。進(jìn)一步在糖尿病患者與非糖尿病患者的肉芽組織實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證CYP代謝酶類(lèi)的表達(dá)差異與創(chuàng)面愈合的關(guān)系。
　　方法:
　　構(gòu)建小鼠背部皮膚損傷模型后，ob/ob小鼠被隨機(jī)

3、地分為11,12-EET治療組、EETS拮抗劑治療組、胰島素治療組、生理鹽水治療組，C57BL/6小鼠被注射生理鹽水作為對(duì)照組。利用Western Blot、real-time PCR、ELISA、免疫組織化學(xué)染色、免疫熒光組織染色等方法，在不同觀察時(shí)間點(diǎn)，檢測(cè)小鼠皮膚創(chuàng)面組織P450表氧化酶(CYP2C65、CYP2J6) mRNA及蛋白表達(dá)水平;中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目、單核/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目、炎癥性細(xì)胞因子水平，即tumor necro

4、sis factor(TNF)-α，interleukin(IL)-6、IL-1β的水平、金屬基質(zhì)蛋白酶蛋白表達(dá)水平以及創(chuàng)面邊緣皮膚組織及新生肉芽組織毛細(xì)血管密度。并觀察外源性EET（11,12-EET）及EETs拮抗劑(14,15-EEZE)干預(yù)后上述各項(xiàng)指標(biāo)的變化及其對(duì)創(chuàng)面愈合指標(biāo)的影響。
　　結(jié)果:
　　1、與C57BL/6小鼠相比，ob/ob小鼠的CYP2C65和CYP2J6的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)

5、;同樣，ob/ob小鼠肉芽組織中CYP2C65和CYP2J6蛋白的表達(dá)水平與對(duì)照鼠相比顯著降低（P＜0.05）。
　　2、生理鹽水干預(yù)后，ob/ob小鼠的創(chuàng)面愈合速率顯著地慢于C57BL/6小鼠;與生理鹽水治療組的ob/ob小鼠相比，11,12-EET可明顯加快ob/ob小鼠的創(chuàng)面愈合(P＜0.05);相反地，EETs拮抗劑可以明顯延緩ob/ob小鼠的創(chuàng)面愈合，而胰島素治療組與生理鹽水治療組的創(chuàng)面愈合速率無(wú)顯著差別（P＜0.05）

6、。
　　3、ob/ob小鼠創(chuàng)面肉芽組織中中性粒細(xì)胞數(shù)目及單核/巨噬細(xì)胞的數(shù)目顯著地多于C57BL/6小鼠。在ob/ob小鼠中，11,12-EET相較于生理鹽水可顯著抑制中性粒細(xì)胞及單核/巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量（P＜0.05）。
　　4、ob/ob小鼠肉芽組織中IL-1β、IL-6及TNF-α的水平顯著高于C57BL/6小鼠(P＜0.05)，ob/ob小鼠經(jīng)11,12-EET治療后，IL-1β、IL-6及TNF-α水平明顯下降（P

7、＜0.05），而經(jīng)胰島素治療后IL-1β、1L-6及TNF-α水平變化不大。
　　5、ob/ob小鼠與C57BL/6小鼠相比，MMP-9的蛋白表達(dá)量明顯升高(P＜0.05)，經(jīng)11,12-EET治療后，MMP-9的蛋白量明顯降低（P＜0.05），而EET拮抗劑治療后，MMP-9表達(dá)量明顯升高(P＜0.05）。
　　6、ob/ob小鼠創(chuàng)面的膠原沉積明顯少于C57BL/6(P＜0.05)。與生理鹽水治療的ob/ob小鼠相比，11

8、,12-EET治療后創(chuàng)面膠原沉積明顯增加（P＜0.05）。同時(shí)，胰島素治療沒(méi)有表現(xiàn)出明顯差別，而EET拮抗劑明顯地抑制膠原沉積（P＜0.05）。
　　7、創(chuàng)面創(chuàng)立第6天，新鮮的肉芽組織的免疫熒光染色顯示ob/ob小鼠的血管樣組織明顯少于C57BL/6小鼠(P＜0.05)。11,12-EET治療后，ob/ob小鼠的血管樣組織相比于生理鹽水治療明顯增加(P＜0.05），經(jīng)胰島素治療后，數(shù)量變化不大。
　　8、將糖尿病與非糖尿病的

9、患者相對(duì)比發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)面肉芽組織中的CYP2C65及CYP2J6蛋白表達(dá)量顯著地低于正常（P＜0.05），但是MMP-9的蛋白表達(dá)量顯著地高于正常（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、糖尿病小鼠的創(chuàng)面肉芽組織CYP表氧化酶的mRNA及蛋白的表達(dá)水平明顯降低。
　　2、經(jīng)EET治療后，ob/ob小鼠的愈合速率顯著增加。
　　3、EET可顯著地減少ob/ob小鼠創(chuàng)面肉芽組織中中性粒細(xì)胞以及單核/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目。

10、>　　4、EET可顯著地使ob/ob小鼠創(chuàng)面肉芽組織中炎癥性細(xì)胞因子表達(dá)量降低。
　　5、EET顯著降地低ob/ob小鼠創(chuàng)面肉芽組織中MMP-9的蛋白表達(dá)。
　　6、EET顯著增加ob/ob小鼠創(chuàng)面肉芽組織的膠原沉積。
　　7、EET顯著可促進(jìn)ob/ob小鼠創(chuàng)面血管生成。
　　8、糖尿病患者的難愈性潰瘍的肉芽組織中CYP2C11及CYP2J2的蛋白表達(dá)量顯著降低，MMP-9的蛋白表達(dá)量顯著升高。
　　總之，