不同鋅鈣摩爾比的鋅修飾硅酸鈣陶瓷涂層對骨髓間充質(zhì)干細胞的生物學(xué)影響及機制研究.pdf

1、目的:
　　骨植入體植入失敗是目前臨床亟待解決的問題。前期研究顯示鋅鈣摩爾比為0.5的鋅修飾硅酸鈣(Ca2ZnSi2O7)陶瓷涂層比硅酸鈣(CaSiO3)陶瓷涂層具有更好的促前成骨細胞粘附、增殖及分化的作用，并能與宿主骨界面形成有效的整合，揭示經(jīng)過Zn離子修飾的CaSiO3陶瓷涂層對前成骨細胞生物學(xué)效應(yīng)產(chǎn)生重要作用。骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)作為體內(nèi)成骨細胞的主要分化來源，探索出對于BMSCs具有最理想生物學(xué)活性鋅鈣摩爾比的C

2、aaZnSi2O7陶瓷涂層，并研究其浸提液對BMSCs的生物學(xué)影響及作用機制顯得尤為重要，為進一步探討其作為骨植入體涂層運用于大體實驗以及骨科和牙科臨床奠定實驗基礎(chǔ)。
　　方法:
　　(1) BMSCs的提取、純化和鑒定。使用全骨髓貼壁法提取SD大鼠BMSCs，培養(yǎng)至第三代后，使用流式細胞術(shù)檢測CD29、CD90、CD45、CD31陽性率，進行成骨成脂誘導(dǎo)分化后，分別行茜素紅和油紅O染色后觀察分化情況，使用免疫熒光染色法進行

3、Vimentin染色后觀察染色情況。
　　(2)構(gòu)建并優(yōu)化Ca2ZnSi2O7陶瓷涂層。采用溶膠-凝膠法并調(diào)節(jié)鋅鈣離子的摩爾比，構(gòu)建鋅鈣摩爾比分別為0.1、0.3、0.5的Ca2ZnSi2O7陶瓷粉體，然后使用大氣等離子噴涂系統(tǒng)(APS)進行噴涂，在特定參數(shù)下獲得Ca2ZnSi2O7陶瓷涂層，檢測涂層表面形貌、化學(xué)穩(wěn)定性及與鈦基底材料的結(jié)合強度等。
　　(3)觀察不同鋅鈣摩爾比的Ca2ZnSi2O7陶瓷涂層對BMSC的生物學(xué)

4、影響。檢測涂層浸提液中的鈣(Ca)、硅(Si)、鋅(Zn)離子濃度。通過CCK-8試劑盒檢測、倒置顯微鏡觀察BMSC在涂層材料表面及其浸提液中培養(yǎng)后的粘附、增殖情況;通過ELISA方法檢測BMSCs在涂層材料表面及其浸提液中添加成骨誘導(dǎo)劑培養(yǎng)后ALP、BGP、COL-Ⅰ的生成情況，茜素紅染色觀察鈣結(jié)節(jié)形成情況，ALP染色觀察ALP分泌情況。探索出促BMSCs生物學(xué)活性最優(yōu)的鋅鈣摩爾比Ca2ZnSi2O7陶瓷。
　　(4) TGF-

5、β1及IGF-1所介導(dǎo)的TGF-β/Smad、MAPK/ERK及PKC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究。使用最適鋅鈣摩爾比的Ca2ZnSi2O7陶瓷涂層作為實驗組，BMSCs在含成骨誘導(dǎo)劑的各組浸提液中培養(yǎng)后，采用qRT-PCR方法檢測成骨標(biāo)記基因ALP、BGP、COL-Ⅰ，TGF-β/Smad信號通路中TGF-β1、Smad2、Smad3，以及MAPK/ERK、PKC信號通路中的IGF-Ⅰ、ERK1、REK2、PKC-δ等關(guān)鍵基因mRNA的表達情況。

6、探索TGF-β/Smad及MAPK及PKC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在Ca2ZnSi2O7陶瓷涂層對BMSCs生物學(xué)影響的作用。
　　結(jié)果:
　?。ㄒ唬┦褂萌撬栀N壁法成功傳代培養(yǎng)出了數(shù)量較多、細胞純度較高的SD大鼠BMSCs，具有良好的分化潛能。
　?。ǘ┏晒χ苽淞虽\鈣摩爾比為0.1、0.3、0.5的Ca2ZnSi2O7陶瓷涂層，各組涂層的表面形貌均較為粗糙，與鈦基的結(jié)合強度均明顯強于CaSiO3陶瓷涂層，三組之間未見明顯區(qū)別;

7、各組材料在DMEM/F12培養(yǎng)液中浸泡1d后，CaSiO3涂層釋放Ca、Si離子濃度最高，而Zn離子濃度同普通培養(yǎng)基一致，Ca2ZnSi2O7陶瓷涂層Ca、Si離子濃度隨著鋅鈣摩爾比的增加而減少，同時Zn離子濃度隨之增加。
　?。ㄈ〣MSCs在三組Ca2ZnSi2O7陶瓷涂層表面及浸提液中粘附和增殖情況均顯著優(yōu)于未涂層鈦合金金屬片及CaSiO3陶瓷涂層，其中鋅鈣摩爾比為0.3的Ca2ZnSi2O7陶瓷涂層顯著優(yōu)于其余兩組;在添加

8、成骨誘導(dǎo)劑的條件下，BMSCs在三組Ca2ZnSi2O7陶瓷涂層表面及浸提液中培養(yǎng)后，成骨分化及生成ALP、COL-Ⅰ、BGP以及鈣結(jié)節(jié)形成情況均顯著優(yōu)于未涂層鈦片及CaSiO3陶瓷涂層，其中鋅鈣摩爾比為0.3的Ca2ZnSi2O7陶瓷涂層顯著優(yōu)于其余兩組。
　?。ㄋ模〣MSCs在各組含成骨誘導(dǎo)劑的浸提液中培養(yǎng)后，ALP、BGP、COL-ⅠmRNA的表達量以及TGF-β1、Smad2、Smad3mRNA的表達量均隨時間變化而升高，

9、鋅鈣摩爾比為0.3的Ca2ZnSi2O7陶瓷涂層的表達量最高，CaSiO3組次之。IGF-Ⅰ、ERK1、ERK2、PKC-δmRNA的表達量隨時間延長而輕度升高，組間無明顯差異，21d時IGF-1mRNA的表達量在鋅鈣摩爾比為0.3的Ca2ZnSi2O7陶瓷涂層浸提液中顯著增多。
　　結(jié)論:
　　不同鋅鈣摩爾比的Ca2ZnSi2O7陶瓷涂層都具有粗糙的表面形貌、豐富的孔隙和生物活性的化學(xué)組分，并可釋放出的生物活性離子，無論是

10、BMSCs在其表面直接培養(yǎng)，還是使用其浸提液進行培養(yǎng)，均表現(xiàn)出了相對于未涂層純鈦金屬片和CaSiO3陶瓷涂層更為優(yōu)秀的促BMSCs粘附、增殖及成骨分化和礦化的能力。其中鋅鈣摩爾比為0.3的Ca2ZnSi2O7陶瓷涂層對BMSCs的生物學(xué)影響最為積極。因此，該涂層對BMSCs擁有更加優(yōu)越的生物相容性和生物活性，顯著促進其粘附、增殖及成骨分化，所釋放出濃度適宜的Zn離子起了至關(guān)重要的作用，并且化學(xué)穩(wěn)定性好，與鈦基結(jié)合強度較高，再加上優(yōu)秀的抗