miRNA-34a靶向ACSL1對肝纖維化發(fā)生發(fā)展的機制研究.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩120頁未讀 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領(lǐng)

文檔簡介

1、本研究擬通過探索miR-34a在臨床肝纖維化病程及原代肝星狀細胞(HSC)自然活化增殖過程中的生物學(xué)特性,應(yīng)用分子生物學(xué)方法分析并驗證miR-34a的靶基因,進而研討miR-34a通過靶基因在肝纖維化病程中的調(diào)控機制,為肝纖維化的早期診斷和治療提供一個新的分子靶點。
  第一部分:miR-34a在肝纖維化進程中的表達及功能研究
  目的:檢測不同分期臨床肝纖維化組織標本和原代HSC自然活化增殖過程中miR-34a表達,分析m

2、iR-34a與肝纖維化進程和HSC活化程度的相關(guān)性。
  方法:1、收集臨床肝纖維化組織標本,應(yīng)用HE染色、Masson染色和Van Gieson(VG)染色對臨床肝纖維化組織進行分期,qRT-PCR檢測miR-34a在臨床不同分期肝纖維化組織中的表達差異。2、Friedman二步分離法提取大鼠原代HSC并進行體外培養(yǎng),臺盼藍染色法、自發(fā)熒光實驗及免疫雙熒光實驗鑒定細胞活性、細胞純度及細胞狀態(tài),qRT-PCR檢測原代HSC體外培養(yǎng)

3、到第2d、第7d和第14d時miR-34a的表達水平。
  結(jié)果:1、依據(jù)METAVIR肝纖維化分期標準,應(yīng)用HE染色、Masson染色和VG染色將臨床肝纖維化組織分為F0期、F1期、F2期、F3期、F4期。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn):與F0期肝組織相比,F(xiàn)1期、F2期、F3期、F4期肝纖維化組織中miR-34a的基因量表達分別增加6.2倍、21.3倍、32.4倍、39.8倍,P<0.05。2、應(yīng)用Fridman二步法提取大鼠原代HS

4、C,通過臺盼藍染色法、自發(fā)熒光實驗鑒定原代HSC細胞純度>95%,細胞存活率>95%;應(yīng)用免疫雙熒光實驗鑒定證實體外培養(yǎng)到第2d的HSC為靜止態(tài),體外培養(yǎng)到第14d的HSC為活化態(tài)。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn):與體外培養(yǎng)2d的HSC(靜止態(tài))相比,體外培養(yǎng)到第7d(半活化態(tài))的HSC中miR-34a表達量增加48.6倍,P<0.05,體外培養(yǎng)到第14d的HSC(活化態(tài))中miR-34a的表達量增加192.0倍,P<0.05。
  結(jié)論

5、:1、miR-34a的基因表達量隨著臨床肝纖維化進程逐漸增加,與肝纖維化病程正相關(guān)。2、miR-34a的基因表達量隨著原代HSC的自然活化增殖逐漸增加,與HSC的活化程度正相關(guān)。
  第二部分:miR-34a靶基因的篩選與驗證
  目的:應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)分析和篩選出miR-34a靶基因長鏈脂酰輔酶A合成酶1(Acy1-CoA synthetase long-chain1,Acsl1),驗證miR-34a與Acsl1的靶向關(guān)

6、系,研究Acsl1在臨床各期肝纖維化組織和原代HSC自然活化增殖過程中的基因和蛋白表達水平。
  方法:1、以mo-miR-34a-5p為檢索詞,在microRNA.org、PicTar、TargetScan、miRDB及miRbase5個數(shù)據(jù)庫進行靶基因預(yù)測,然后在Gene Ontology數(shù)據(jù)庫進行靶基因的功能顯著性(GO)分析,KEGG數(shù)據(jù)庫進行代謝通道的pathway分析,結(jié)合本課題組前期預(yù)實驗利用動物肝纖維化組織所獲取的

7、miRNA-mRNA表達譜,構(gòu)建miRNA-Gene-Network,篩選出miR-34a-5p的靶基因。2、應(yīng)用pMIR-REPORT載體構(gòu)建Acsl1野生型(WT)和突變型(MUT)質(zhì)粒,雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證miR-34a與Acsl1的靶向關(guān)系。3、應(yīng)用qRT-PCR、Western Blot和免疫組化檢測ACSL1在臨床不同分期肝纖維化組織以及原代HSC自然活化增殖過程中的表達差異,分析其與miR-34a表達的相關(guān)性。

8、>  結(jié)果:1、以rno-miR-34a-5p為檢索詞,在microRNA.org、PicTar、TargetScan、miRDB及miRbase5個數(shù)據(jù)庫進行靶基因預(yù)測,取每個數(shù)據(jù)庫前50的預(yù)測結(jié)果的交集為可能的靶基因。然后在Gene Ontology數(shù)據(jù)庫進行靶基因的GO分析,KEGG數(shù)據(jù)庫進行代謝通道的pathway分析。結(jié)合本課題組預(yù)實驗利用動物肝纖維化組織得到的miRNA-mRNA表達譜,構(gòu)建出miRNA-Gene-Netwo

9、rk,發(fā)現(xiàn)Acsl1位于該網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控中心,受miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-19a、miR181a等5個miRNA的共同調(diào)控,因此Acsl1可能為mo-miR-34a的靶基因。2、通過生物信息技術(shù)分析,我們預(yù)測miR-34a-5p位點上有7個核糖核苷酸與Acsl13’-UTR的161-167位點互補,PCR擴增3’-UTR(Acsl1)序列構(gòu)建于載體luciferase下游的MluI和HindⅢ,構(gòu)建出Acsl1

10、 WT質(zhì)粒。再利用點突變技術(shù)將結(jié)合位點進行突變,構(gòu)建入pMIR-REPORT luciferase載體的螢光素酶報告基因下游,構(gòu)建出Acsl1 MUT質(zhì)粒。與共轉(zhuǎn)染Acsl1 WT質(zhì)粒和NC序列的293T工具細胞相比,共轉(zhuǎn)染Acsl1 WT質(zhì)粒和miR-34a inhibitor的工具細胞的Firefly luciferase/Renialla luciferase比值明顯上升,P<0.05,說明miR-34a對Acsl1有直接負向調(diào)控

11、作用。與共轉(zhuǎn)染Acsl1 MUT質(zhì)粒和NC序列的工具細胞相比,共轉(zhuǎn)染Acsl1 MUT質(zhì)粒和miR-34a inhibitor后,其Firefly luciferase/Renialla luciferase比值無明顯差異,P>0.05,該結(jié)果說明當Acsl13’端161-167位點發(fā)生點突變后,miR-34a不能與之特異結(jié)合,對其負向調(diào)控作用消失。Acsl1是mo-miR-34a-5p的直接作用靶點。3、qRT-PCR檢測結(jié)果顯示:F

12、1期、F2期、F3期、F4期臨床肝纖維化組織中ACSL1的mRNA表達量分別為F0期肝組織的72.2%、44.4%、32.0%、22.2%,P<0.05。相關(guān)性分析結(jié)果顯示:ACSL1在肝纖維化組織中mRNA表達量與miR-34a負相關(guān),R2=0.8221,P<0.05。Western Blot檢測和免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示:從F0期到F4期,ACSL1的蛋白表達量逐步減少。
  4、qRT-PCR檢測結(jié)果顯示:與體外培養(yǎng)到第2d

13、的靜止態(tài)HSC相比,體外培養(yǎng)到第7d、第14d時,Acsl1的mRNA表達量分別下降22.3%、55.4%,P<0.05。相關(guān)性分析結(jié)果顯示:Acsl1在HSC中的表達量與miR-34a負相關(guān),R2=0.9612,P<0.05。Western Blot檢測結(jié)果顯示,體外培養(yǎng)到第2d、第7d、第14d的Acsl1的蛋白表達量逐步減少。
  結(jié)論:1、Acsl1為miR-34a的靶基因。2、隨著臨床肝纖維化進展,ACSL1的基因和蛋白

14、表達水平明顯降低,ACSL1的mRNA表達量與miR-34a表達呈負相關(guān)。3、隨著HSC的活化,Acsl1的mRNA和蛋白表達水平逐步下降,HSC細胞中Acsl1的mRNA表達量與miR-34a表達呈負相關(guān)。
  第三部分:miR-34a靶向Acsl1參與HSC活化增殖的相關(guān)研究
  目的:驗證miR-34a靶向Acsl1對HSC活化增殖的生物學(xué)行為作用。
  方法:1、以aH-SC為研究對象,將miR-34a inh

15、ibitor轉(zhuǎn)染進入細胞中,檢測Acsl1和肝纖維化指標Ⅰ型膠原(ColI)和α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的mRNA和蛋白表達水平。2、利用aHSC構(gòu)建Acsl1干擾穩(wěn)定細胞株,檢測肝纖維化相關(guān)指標的mRNA和蛋白表達水平,判斷Acsl1對肝纖維化進程的影響。3、回復(fù)實驗(rescue assay)進一步驗證miR-34a靶向Acsl1對HSC表型的調(diào)控。
  結(jié)果:1、與體外培養(yǎng)到第2d的HSC相比,體外培養(yǎng)到第14d的HSC

16、中ColI的表達增加8.7倍,α-SMA的表達增加2.7倍,P<0.05。Western Blot結(jié)果顯示:與體外培養(yǎng)到第2d的HSC相比,ColI和α-SMA的蛋白表達亦出現(xiàn)顯著增加。2、與NC組比較,aHSC轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor后Acsl1的mRNA表達量增加1.7倍,P<0.05,ColI和α-SMA的mRNA表達量分別減少41.8%和63.5%,P<0.05;而blank組與NC組相比,Acsl1、ColI和α

17、-SMA的mRNA表達量無顯著差異,P>0.05。inhibitor組中Acsl1的蛋白表達量較NC組顯著增加,ColI和α-SMA的蛋白表達量顯著下降,而NC組和blank組中Acsl1、ColI和α-SMA蛋白表達差異不顯著。4、Acsl1干擾穩(wěn)定細胞株分別轉(zhuǎn)染NC和miR-34a inhibitor后,兩組Col1和α-SMA的蛋白表達無顯著差異;與轉(zhuǎn)染NC序列的干擾對照細胞株相比,轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor的干擾對照

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論