肝靶向β-雌二醇納米粒制備及抗肝纖維化的實驗研究.pdf

1、研究目的: 本研究的目的為1、以氰基丙烯酸正丁酯(BCA)為載體材料，通過界面聚合法將β-雌二醇(E<,2>)包裹到納米載體中，制備肝靶向聚氰基丙烯酸正丁酯β-雌二醇納米粒(E2-PBCA-NP)。2、比較雌二醇納米化前后對豬血清誘導的肝纖維化動物模型纖維化程度的治療效果。3、進一步探討肝靶向納米粒E2-PBCA-NP和β-雌二醇治療肝纖維化的可能性。通過抑制大鼠肝纖維化動物模型的肝星狀細胞(HSC)活化，提高抗氧化能力，下調(diào)T

2、GF-β、CTGF和TIMP-1的表達，上調(diào)MMP-1的表達，進一步研究E2和E2-PBCA-NP抗肝纖維化作用的可能機制。 研究方法: 1、選擇BCA為載體材料，用界面聚合法研制了E<,2>-PBCA-NP。以E<,2>-PBCA-NP的包封率、形態(tài)、粒徑及其分布作為評價指標，采用單因素試驗作初選，均勻設計試驗作精選的方法，優(yōu)選出制備E<,2>-PBCA-NP的最佳制備工藝。 2、用制備E<,2>-PBCA-N

3、P類似的方法制備<'125>I-E<,2>納米粒(<'125>I-E<,2>-PBCA-NP)；經(jīng)尾靜脈注射<'125>I-E<,2>和<'125>I-E<,2>-PBCA-NP及腹腔注射<'125>I-E<,2>-PBCA-NP后，在不同的時間點比較三組小鼠各組織中的<'125>I放射性強度，計算靶向指數(shù)，評價<'125>I-E<,2>-PBCA-NP在各個器官中的分布。 3、體外培養(yǎng)人肝細胞株L-02作為體外細胞模型，采用對

4、照分組，檢測各組不同藥物濃度培養(yǎng)上清液LDH活性，以及用MTT法檢測細胞生長指數(shù)觀察E2-PBCA-NP、E<,2>和空白納米粒對肝細胞生長的影響和對肝細胞的毒性。 4、用不同劑量β-雌二醇和β-雌二醇納米粒作為干預藥物，對SD大鼠肝星狀細胞株(HSC-T6)進行干預治療。用噻唑藍(MTT)法檢測細胞生長指數(shù)；免疫細胞化學檢測HSC-T6 α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達；免疫組化法檢測肝纖維化動物模型各組肝臟組織α-SM

5、A蛋白的表達。 5、β-雌二醇和β-雌二醇納米?？垢卫w維化作用機制研究：將SD大鼠隨機分成7組，每組10只，除正常對照組外，其余6組均腹腔注射豬血清(0.5 ml／次，2次／周)。β-雌二醇納米粒早期治療組在第5周給予腹腔注射藥物每周兩次；β-雌二醇納米粒晚期治療組、β-雌二醇治療組、γ-干擾素治療組、空白納米粒組、對照組和模型組在第9周給予腹腔注射相應的干預藥物，每周兩次；在12周末處死大鼠。(1)HE和Masson染色觀察肝

6、臟病理改變。(2)留取血清和肝組織勻漿，用比法色檢測各組總抗氧化能力(T-AOC)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、谷胱甘肽(GSH)四項指標。(3)RT-PCR檢測肝組織中I、Ⅲ膠原、TGF-β<'14>、CTGF、MMP-1和HMP-1mRNA的表達，同時免疫組化觀察TGF-β及CTGF蛋白的表達。(4)TGF-β<,1>和CTGF、MMP-1和TIMP-1之間作相關性分析。 6、將24只雌性大鼠隨機分成四組，包括

7、對照組、模型組、β-雌二醇納米粒和β-雌二醇治療組。除對照組外，其余3組均腹腔注射豬血清，兩組治療組在第9周腹腔注射β-雌二醇納米粒和β-雌二醇干預，在12周末處死大鼠。觀察各組性器官的重量和子宮內(nèi)膜增生的狀況。 結(jié)論: 1、通過優(yōu)選工藝制得的β-雌二醇納米粒大小、形狀、包封率可以滿足本實驗研究的需要，該優(yōu)化工藝條件可作為β-雌二醇納米粒的最佳制備工藝。 2、β-雌二醇納米粒具有良好的肝靶向性。 3、空白

8、納米粒和β-雌二醇納米粒在10<'-6>mol／1的濃度范圍內(nèi)對肝細胞L-02無細胞毒性作用。 4、納米化后的β-雌二醇仍具有抗肝纖維的作用，與無納米化β-雌二醇比較抗肝纖維的作用更強。 5、β-雌二醇抗肝纖維化作用可能是通過抗氧化、抑制肝星狀細胞增殖和肝星狀細胞的α-SMA表達，降低Ⅰ、Ⅲ型膠原產(chǎn)生，抑制與肝纖維化有關的細胞因子。TGF-β及其下游信號CTGF的表達，以及促進膠原降解MMP-1的表達和抑制TIMP-1的