基于非病毒納米基因傳遞系統(tǒng)的細胞重編程研究.pdf

1、2006年，Yamanaka等首次實現(xiàn)了由轉(zhuǎn)錄因子介導的體細胞重編程，命名為誘導多能干細胞(iPSCs)，自此，細胞重編程技術(shù)成為生命科學與再生醫(yī)學領(lǐng)域的研究熱點。通過病毒等載體介導，在體細胞內(nèi)異位表達與細胞多能性相關(guān)的關(guān)鍵因子（如Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4等），可以實現(xiàn)體細胞向多能狀態(tài)的逆轉(zhuǎn)，最終生成表型和分化潛能均類似于胚胎干細胞的iPSCs。由于iPSCs來源于患者自身的體細胞，且具有與胚胎干細胞相當?shù)淖晕腋履芰?/p>

2、向三胚層分化的潛能，將iPSCs作為一種替代胚胎干細胞的種子細胞應(yīng)用于臨床，可避免胚胎干細胞涉及的倫理和法律問題，且iPSCs源于患者自身體細胞，可實現(xiàn)病人的個性化治療。目前，iPSCs的臨床應(yīng)用還面臨許多困難，諸如，傳統(tǒng)的病毒轉(zhuǎn)染方法和癌癥相關(guān)因子（如c-Myc）的應(yīng)用存在安全隱患，而非病毒方法的重編程效率低下，難以滿足臨床對于iPSCs安全性和數(shù)量的需求等等，因此，研究探索安全、高效的重編程策略具有重要的價值和意義。本文從基于天然多

3、糖的重編程轉(zhuǎn)錄因子OCT4納米傳遞、重編程因子組合的篩選、基于組織工程三維體系的細胞重編程三個方面，研究探索安全、高效的體細胞重編程新策略。
　　第一章細胞重編程的研究進展
　　對細胞重編程的概念及研究進展進行了闡述;對細胞重編程技術(shù)在人類疾病治療、藥物開發(fā)以及生物發(fā)育等領(lǐng)域的應(yīng)用和意義進行了探討;通過大量資料查閱，對細胞重編程的方法進行了綜述;闡述了細胞重編程技術(shù)的研究現(xiàn)狀及其應(yīng)用于臨床實踐所面臨的問題，提出了本論文的立題

4、依據(jù)、設(shè)計思路與構(gòu)想，為本論文實驗工作的順利進行提供了理論依據(jù)。
　　第二章基于天然多糖的重編程轉(zhuǎn)錄因子OCT4納米傳遞研究
　　采用水提醇沉、樹脂純化的工藝提取分離了4種高純度、分子量分布集中的天然多糖（文中分別以字母A、B、C、D表示）;采用三種陽離子化方法，即精胺(Sp)、乙二胺(Ed)和聚乙烯亞胺(PEI)修飾的方法，分別對所得的每種多糖進行陽離子化修飾;選擇與體細胞重編程密切相關(guān)的胚胎干細胞轉(zhuǎn)錄因子OCT4作為模型

5、基因，通過瓊脂糖凝膠電泳篩選出了與質(zhì)粒OCT4的結(jié)合效果最佳的4種陽離子多糖（A-Ed、B-PEI、C-Ed和D-Sp）進行后續(xù)基因轉(zhuǎn)染效率評價;透射電鏡觀察、粒徑分析以及Zeta電位測定結(jié)果表明:陽離子多糖能有效壓縮、包裹大分子質(zhì)粒OCT4，得到形態(tài)規(guī)則、表面帶正電荷的球形或橢球形的納米粒;MTT比色法證明了陽離子多糖/OCT4納米粒具有良好的生物安全性;酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、RT-PCR以及活細胞工作站等技術(shù)分別從目的蛋白表

6、達水平、RNA轉(zhuǎn)錄水平以及納米粒入胞過程等方面對陽離子多糖/OCT4納米粒的基因轉(zhuǎn)染效率進行綜合評價，從多方面證明了陽離子多糖是一種理想的細胞重編程載體材料。
　　第三章重編程因子組合的篩選與細胞重編程研究
　　通過對OCT4、SOX2和miR302-367這3個因子進行隨機組合，采用陽離子多糖D-Sp作為基因載體，制備了一系列多糖-基因納米粒;以qRT-PCR考察了細胞轉(zhuǎn)染效率，并通過堿性磷酸酶染色，統(tǒng)計陽性克隆數(shù)，篩選出

7、了最佳的因子組合:OCT4、SOX2和miR302-367;選用該組合與陽離子多糖D-Sp制備得到D-Sp/OS-miR納米粒，對人源體細胞進行重編程研究;經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、透射電鏡觀察、粒徑測定以及電位測量等一系列檢測，結(jié)果顯示:D-Sp/OS-miR納米粒在質(zhì)量比為10∶1時，粒徑最小，且集中分布在70～150 nm的區(qū)間內(nèi)，納米粒呈形態(tài)規(guī)整、分散均勻、表面帶正電荷的球形或橢球形;qRT-PCR、免疫熒光、Western blot以

8、及HE組織染色等方法證明了D-Sp/OS-miR納米粒誘導生成的iPSCs能夠表達胚胎干細胞多能性標記，并且在體、內(nèi)外均能夠向內(nèi)、中、外三個胚層進行分化。
　　第四章基于組織工程三維體系的細胞重編程研究
　　首次嘗試在三維體系中細胞重編程的可能性。采用直接凍干、不添加任何交聯(lián)劑的方法制備了膠原支架，并對支架進行了形態(tài)、孔隙率和吸水率等表征;以陽離子多糖D-Sp、磷酸鈣以及編碼Yamanaka因子的4種質(zhì)粒為原料，采用反相微乳

9、法制備了多糖-磷酸鈣混雜納米粒，通過形態(tài)觀察、粒徑測定、Zeta電位測量以及瓊脂糖凝膠電泳等實驗對納米粒的性質(zhì)進行了表征;將多糖-磷酸鈣混雜納米粒吸附到空白膠原支架內(nèi)表面，得到三維載基因納米粒-膠原支架;掃描電鏡下觀察到三維載基因納米粒-膠原支架內(nèi)部疏松多孔的微觀結(jié)構(gòu)，孔徑適宜、相互連通的支架孔道有效模擬了細胞在體內(nèi)生長的三維微環(huán)境;將人臍帶間充質(zhì)干細胞接種于三維載基因納米粒-膠原支架進行重編程，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞在支架中形成了邊

10、界清晰、形態(tài)規(guī)整的球形或橢球形的iPSC細胞球;RT-PCR檢測結(jié)果顯示:在三維載基因納米粒-膠原支架中，每一個重編程轉(zhuǎn)錄因子的表達量都顯著高于二維體系（*，P＜0.05），且持續(xù)時間延長;HE染色、免疫組化、免疫熒光、染色體核型分析以及啟動子甲基化測定等實驗從形態(tài)、蛋白水平以及基因水平等多方面證明了iPSCs細胞球的多能性;在三維支架中誘導生成的細胞球能夠在二維滋養(yǎng)層細胞上持續(xù)、穩(wěn)定地傳代至20代以上，并建立穩(wěn)定的細胞系;體內(nèi)畸胎瘤實

11、驗最終證明:三維載基因納米粒-膠原支架能夠成功誘導iPSCs的生成。
　　本論文成功篩選出基于天然多糖的非病毒納米基因載體，并應(yīng)用于重編程轉(zhuǎn)錄因子OCT4納米傳遞，通過對納米粒的表征和基因轉(zhuǎn)染效率的考察，證明了陽離子多糖作為重編程基因載體的巨大潛能;以安全性良好的microRNA替代癌癥相關(guān)基因C-MYC和KLF4，形成一個全新的非致癌三因子組合，OCT4+SOX2+miR302-367，然后以篩選出的陽離子多糖為基因載體，成功誘