中藥多糖的三維納米基因傳遞研究.pdf

1、基因治療能否成功很大程度上取決于是否具有安全高效的基因傳遞系統(tǒng)，如何開發(fā)合適的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體是基因治療研究的關(guān)鍵問題。本研究著重于將傳統(tǒng)中藥的多糖成分應(yīng)用于基因傳遞，開發(fā)陽離子化多糖基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，并結(jié)合聚乳酸-羥基乙酸(poly-lactide-co-glycolide，PLGA)支架構(gòu)建三維基因傳遞系統(tǒng)。中藥多糖三維基因傳遞系統(tǒng)不僅為尋找安全高效的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體提供新的思路，同時也為中藥資源的多樣化應(yīng)用提供實(shí)驗基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。
　　

2、 以傳統(tǒng)中藥ASD為原料，采用水提醇沉法提取粗多糖，再依次通過二乙氨乙基-纖維素-52離子交換柱和SephadexG-100葡聚糖凝膠柱分離純化出中性總多糖成分(ASDP)。ASDP主要由葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成，其糖醛酸含量為16.8％，總糖含量為96.1%。當(dāng)濃度在0.25～5μg·mL-1范圍內(nèi)時，ASDP能促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stem cell，BMSC）的增殖，其中在0.25～3μg·mL-

3、1濃度范圍內(nèi)ASDP對BMSC的增殖率表現(xiàn)為濃度依賴型，且均高于陽性對照纖維粘連蛋白。
　　 中藥多糖本身不帶正電荷，不具有DNA親和性，需要將其進(jìn)行陽離子化才能結(jié)合DNA。本文先使用N，N'-羰基二咪唑?qū)SDP中的羥基氧化成醛基，再與小分子(1300Da)聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI)反應(yīng)生成酰胺鍵，將PEI接枝到ASDP上，得到陽離子化的ASDP(CASDP)。以轉(zhuǎn)化生長因子質(zhì)粒(plasmid

4、transforming growth factor-β1，pTGF-β1)為報告基因，不同質(zhì)量比制備CASDP/pTGF-β1納米粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)當(dāng)WCASDP/WpTGF-β1比值大于l時，CASDP可以將pTGF-β1完全滯留在原孔，證明CASDP成功連接PEI后，攜帶正電荷并具有核酸親和性。CASDP/pTGF-β1納米粒的zeta電位隨著納米粒中CASDP比例的增大而升高。CASDP/pTGF-β1納米粒(WpTGF

5、-β1/WCASDP=1∶10)為均一球體，平均粒徑大小為134nm。使用三種比例的CASDP/pTGF-pi納米粒(WpTGF-βI/WCASDP＝1∶5，1∶10，1∶20)處理BMSC后，其TGF-pi表達(dá)水平均高于脂質(zhì)體、PEI和游離質(zhì)粒對照組。其中，當(dāng)WpTGF-β1/WCASDP為1:20時，納米粒的轉(zhuǎn)染效率最高。
　　 以靜電紡絲法制成的PLGA薄膜支架為研究對象，考察BMSC細(xì)胞在PLGA支架上進(jìn)行三維培養(yǎng)的可行

6、性。選擇接種效率較高的沉淀接種法接種BMSC細(xì)胞，以4x104個/mL為接種密度，可以在保證細(xì)胞數(shù)量的同時使細(xì)胞具有一定的生長空間。倒置顯微鏡拍攝的照片顯示，所接種的BMSC細(xì)胞可以緊密粘附在PLGA纖維上，提示此PLGA薄膜支架適宜于BMSC的三維培養(yǎng)。在此前提下，選擇轉(zhuǎn)染效率最高的CASDP/pTGF-β1納米粒(WpTGF-β1/WCASDP=1∶20)，以靜置-凍干法與PLGA支架復(fù)合，制成3D-CASDP/pTGF-β1轉(zhuǎn)染系