柑橘碎葉病毒侵染性克隆構(gòu)建及其誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)體系建立.pdf

1、柑橘是世界第一大水果。我國柑橘栽培面積超過290萬公頃，產(chǎn)量達(dá)3000萬噸，均居世界第一位。隨著克里曼丁紅橘（Citrus clementina Hort.exTan）和甜橙(C sinensis cv.Valencia)全基因組序列的公布，以及柑橘抗病、抗逆等相關(guān)基因序列表達(dá)標(biāo)簽(Expressed sequence tags，EST)的大量累積，柑橘基因功能解析已成為目前的研究熱點(diǎn)和挑戰(zhàn)之一。病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus-indu

2、ced gene silencing，VIGS)是近年來發(fā)展的一種基因功能研究工具，與轉(zhuǎn)基因、基因敲除、反義抑制等常用生物技術(shù)相比，試驗(yàn)周期短，不需要遺傳轉(zhuǎn)化，具有操作簡便、成本低、高通量等優(yōu)勢。利用VIGS技術(shù)有望克服柑橘這種多年生木本作物童期長、遺傳轉(zhuǎn)化困難等瓶頸，加速其基因功能研究的進(jìn)展。為此，本研究在柑橘碎葉病毒（Citrus tatter leaf virus，CTLV）檢測方法及多態(tài)性研究的基礎(chǔ)上，篩選CTLV分離株進(jìn)行全基

3、因組cDNA擴(kuò)增、侵染性克隆構(gòu)建，并進(jìn)一步開展了在模式植物本生煙（Nicotiana benthamiana）上建立VIGS體系的研究，以期為在柑橘上實(shí)施VIGS進(jìn)而研究其基因功能奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.CTLV一步法及巢式RT-PCR檢測體系建立
　　 通過引物比對，建立了CTLV的一步法及巢式RT-PCR檢測體系。其中，一步法RT-PCR產(chǎn)物889bp，包含整個(gè)CP及3′UTR序列，比目前的常規(guī)RT-

4、PCR操作簡便，污染幾率小;巢式RT-PCR檢測靈敏度高，比一步法RT-PCR至少提高100倍，檢測模板總核酸的最低濃度約1.27pg/μL。
　　 2.CTLV多態(tài)性分析
　　 建立了CTLV分子變異的HinfⅠ/RFLP檢測體系，定義RFLP組群9個(gè)，發(fā)現(xiàn)CTLV以單一RFLP組群侵染為主，其中RFLPⅠ和RFLPⅡ組群可能是優(yōu)勢流行組群，但也存在混合侵染。該體系簡便、快速、重復(fù)性好，可用于大規(guī)模樣品的分子變異檢測。

5、
　　 對收集保存的18份CTLV分離株進(jìn)行了指示植物鑒定、3′端序列分析及RFLP檢測。結(jié)果表明，在指示植物臘斯克枳橙(C sinensis×Poncirus trifoliata cv.Rusk)上表現(xiàn)弱到中等強(qiáng)度癥狀的6個(gè)分離株均屬于或攜帶有RFLPⅡ或RFLPⅢ組群，而其它RFLP組群均表現(xiàn)出強(qiáng)毒株特征。在根據(jù)3′端序列(889bp)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹上，CTLV分離株聚為了2個(gè)同源性組群，同源性組群A包含的8個(gè)序列均為R

6、FLP Ⅱ或RFLP Ⅲ組群;同源性組群B則包含了其它RFLP組群的所有序列。同時(shí)，在指示植物上表現(xiàn)較弱癥狀的多數(shù)(4/6)CTLV分離物劃分在A組群，多數(shù)(10/12)CTLV強(qiáng)毒分離物則劃分在B組群。
　　 可見，指示植物上的弱（中）毒分離株侵染癥狀-RFLP Ⅱ或RFLP Ⅲ組群-同源性A組群三者之間可能存在某種內(nèi)在聯(lián)系。RFLP組群檢測可用于研究CTLV的分子變異，對于快速鑒定CTLV致病性強(qiáng)弱可能具有參考價(jià)值。

7、　　 3.CTLV基因組全長cDNA擴(kuò)增及序列分析
　　 在通過RACE技術(shù)獲得末端精確序列的基礎(chǔ)上，建立了CTLV全長的RT-PCR體系，進(jìn)而擴(kuò)增并克隆了CTLV新會(huì)橙分離株及滿頭紅分離株基因組全長cDNA。序列分析表明，CTLV-XHC（登錄號(hào)KC588947）和CTLV-MTH（登錄號(hào)KC588948）基因組全長均為6497nt[不包括3′poly(A)尾巴]，均包含2個(gè)開放讀碼框，在推定的CP及MP上游均具有保守的亞基

8、因組啟動(dòng)子核心序列“UUAGGU”，與目前已報(bào)道的CTLV及蘋果莖溝病毒(Apple stem grooving virus，ASGV)的基因組結(jié)構(gòu)一致。
　　 同登錄GenBank的所有CTLV及ASGV全基因組序列比對顯示，CTLV-XHC與我國砂糖橘分離株CTLV-S序列一致性最高，為98％，在依據(jù)全基因組核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹上，CTLV-XHC與柑橘來源的CTLV分離株聚為一簇;有趣的是，CTLV-MTH與日本AS

9、GV分離物序列一致性最高，為91％，而與臺(tái)灣甜橙分離株CTLV-LC一致性最低，為82.0％，在系統(tǒng)進(jìn)化樹上CTLV-MTH與多數(shù)ASGV分離株聚為一簇。這一結(jié)果對于CTLV與ASGV的起源進(jìn)化關(guān)系具有啟示意義。
　　 4.CTLV侵染性克隆構(gòu)建
　　 對6個(gè)CTLV基因組全長cDNA克隆進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄并摩擦接種昆諾藜（Chenopodium quinoa），癥狀觀察及RT-PCR檢測結(jié)果表明，CTLV-XHC和CTLV-

10、MTH的體外轉(zhuǎn)錄物具有侵染性。
　　 為獲得適于農(nóng)桿菌介導(dǎo)接種的CTLV侵染性克隆，以pCAMBIA1301為骨架構(gòu)建了雙元植物表達(dá)載體pCSSN:LB-2x35S-MCS-NOS-RB，通過瞬時(shí)表達(dá)GFP驗(yàn)證其有效性后，采用分步克隆策略將CTLV-XHC和CTLV-MTH分別插入到pCSSN載體2x35S啟動(dòng)子與NOS終止子之間。經(jīng)篩選、鑒定獲得了CTLV侵染性克隆pCSSN-XHC和pCSSN-MTH。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的本生煙（N

11、.benthamiana）注射接種實(shí)驗(yàn)表明，二者的侵染癥狀與野生型病毒對照無明顯差異，接種時(shí)共表達(dá)沉默抑制子p19提高了pCSSN-XHC和pCSSN-MTH的侵染率。
　　 5.CTLV誘導(dǎo)的VIGS體系建立
　　 以CTLV侵染性克隆pCSSN-XHC為基礎(chǔ)，通過重組克隆在CP終止子之后引入NruⅠ識(shí)別序列，構(gòu)建了VIGS載體pCTLV-00:LB-2x35S-XHC(NruⅠ)-NOS-RB。反向插入402bp源于

12、本生煙的八氫番茄紅素脫氫酶(Phytoene desaturase，PDS)基因片段后，重組載體pCTLV-PDS402R通過農(nóng)桿菌浸潤接種本生煙，在22℃光照16h和20℃黑暗8h周期條件下，誘導(dǎo)產(chǎn)生了PDS基因沉默的白化表型。Real-timeRT-PCR檢測結(jié)果表明，pCTLV-PDS402R侵染植株P(guān)DS基因的相對表達(dá)量比空載體pCTLV-00對照下降約25％。說明基于CTLV上的VIGS體系初步建立。
　　 為提高VI