hTERT-ZEB1通路促進結腸癌細胞上皮間葉轉化(EMT)的分子機制研究.pdf

1、目的:
　　在人類腫瘤中，腫瘤侵襲性和轉移性潛力與高端粒酶的表達密切相關。端粒酶逆轉錄酶(hTERT)可以通過誘導端粒酶的活化增強端粒的穩(wěn)定性，從而導致細胞的惡變。以往的研究表明，端粒酶可以促進胃癌、肝癌以及食道癌的侵襲和轉移。作為腫瘤侵襲、轉移的基本前提，上皮間質轉化(EMT)在腫瘤的侵襲、轉移過程中起著非常關鍵的作用。在多種腫瘤當中hTERT可以通過Wnt信號促進EMT的發(fā)生，但是hTERT是否可以通過其它途徑促進腫瘤EMT的

2、發(fā)生，至今沒有相關報道。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)在結腸癌細胞中，hTERT可以和鋅指E-box結合同源盒1(ZEB1)形成復合物直接綁定到E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的啟動子，從而抑制E-cadherin的表達并促進EMT的發(fā)生。在HCT116和SW480細胞中過表達hTERT可以抑制E-cadherin的表達，但是干擾了ZEB1后即使過表達了hTERT基因，E-cadherin的表達仍然可以恢復?？傊?，我們的研究結果表明hTERT可

3、以通過在ZEB1途徑促進EMT的發(fā)生，以hTERT、ZEB1為靶點的治療可以為預防、治療腫瘤的轉移提供新的途徑。
　　方法:
　　第一部分:人端粒酶逆轉錄酶通過非Wnt信號通路促進結腸癌上皮間葉轉化的機制研究
　　1、采用Real-time PCR、免疫熒光及Western-blot技術檢測結腸癌細胞過表達hTERT的情況，以及過表達hTERT后結腸癌細胞的形態(tài)及E-cadherin、N-cadherin等相關標志物的

4、變化，以檢測hTERT對結腸癌細胞EMT的影響;
　　2、采用雙熒光素酶實驗檢測在結腸癌細胞中hTERT的過表達對E-cadherin啟動子的影響;
　　3、Top-Fop實驗檢測在SW480、HCT116過表達hTERT及加入Wnt抑制劑XAV后Wnt信號通路的活性，同時Western-blot及免疫熒光檢測E-cadherin的變化。以檢測hTERT及XAV對SW480、HCT116細胞Wnt信號通路的影響;
　　

5、4、雙熒光素酶實驗檢測hTERT、XAV對SW480、HCT116細胞E-cadherin啟動子活性的影響;
　　5、Western-bolt技術分別在SW480、HCT116細胞中檢測hTERT對β-catenin入核情況的影響，用來檢測hTERT是否會通過促進β-catenin進入細胞核而影響Wnt信號通路的活性。
　　第二部分:人端粒酶逆轉錄酶通過ZEB1促進結腸癌上皮間葉轉化的分子機制研究
　　1、免疫共沉淀技

6、術和激光共聚焦技術檢測hTERT、ZEB1的結合及在細胞中的定位，證實hTERT/ZEB1蛋白復合體的存在;
　　2、通過染色質免疫共沉淀技術檢測hTERT與E-cadherin啟動子結合情況及結合位點;
　　3、通過Western-bolt技術及免疫熒光技術檢測過表達hTERT同時干擾掉ZEB1后E-cadherin、N-cadherin等蛋白的表達，以證實hTERT是否會通過ZEB1促進結腸癌細胞EMT的發(fā)生;
　

7、　4、通過染色質免疫共沉淀技術檢測hTERT是否是通過ZEB1與E-cadherin啟動子結合。
　　5、劃痕實驗、Transwell及裸鼠尾靜脈注射實驗證實從體內、體外兩方面證實hTERT是否可以通過ZEB1促進結腸癌細胞的侵襲轉移。
　　結果:
　　第一部分:人端粒酶逆轉錄酶通過非Wnt信號通路促進結腸癌上皮間葉轉化的研究
　　1、在SW480和HCT116細胞中hTERT可以促進細胞形態(tài)學上發(fā)生上皮間葉的改

8、變;
　　2、Western blot和免疫熒光實驗結果表明hTERT可以顯著降低E-cadherin蛋白的表達，而N-cadherin和Vimentin的表達顯著升高;
　　3、qPCR分析發(fā)現(xiàn)過表達hTERT后間質標志物Snai1在SW480細胞中表達升高，而HCT116細胞并沒有變化;
　　4、雙熒光素酶實驗證實了在SW480、HCT116結腸癌細胞中hTERT可以抑制E-cadherin啟動子的活性;
　

9、　5、Top-Fop實驗發(fā)現(xiàn)在SW480細胞中hTERT可以活化Wnt信號通路，但是在HCT116細胞中Wnt信號通路的活性并沒有改變;
　　6、我們用Wnt信號通路抑制劑XAV處理SW480和HCT116細胞，發(fā)現(xiàn)XAV可以抑制SW480細胞的Wnt信號通路活性，E-cadherin蛋白表達也有所恢復，而HCT116細胞的Wnt信號通路活性及E-cadherin的表達并無改變;
　　7、我們在SW480和HCT116細胞中

10、抑制了Wnt信號通路的關鍵因子β-catenin，結果同樣顯示SW480細胞的Wnt信號通路被抑制，E-cadherin表達升高，HCT116細胞Wnt信號通路及E-cadherin沒有改變;
　　8、Western blot檢測SW480、HCT116細胞過表達hTERT后β-catenin的入核情況，發(fā)現(xiàn)hTERT可以促進SW480細胞的β-catenin進入細胞核，而HCT116細胞核的β-catenin沒有改變;
　

11、　9、我們在SW480和HCT116細胞中抑制Wnt信號通路后，雙熒光素酶實驗發(fā)現(xiàn)在SW480細胞中E-cadherin啟動子活性可以恢復，而HCT116細胞E-cadherin的啟動子活性無變化。
　　第二部分:人端粒酶逆轉錄酶通過ZEB1促進結腸癌上皮間葉轉化的分子機制研究
　　1、免疫共沉淀證實了在HCT116細胞中hTERT可以與ZEB1相互作用。結果顯示我們在hTERT中可以拉出ZEB1，同樣的在ZEB1中我們也可

12、以拉出hTERT。激光共聚顯微鏡也觀察到了hTERT和ZEB1在HCT116細胞中的共定位;
　　2、針對ZEB1與E-cadherin啟動子E-box區(qū)域的結合位點我們設計了3條引物，染色質免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)hTERT可以和E-cadhernin啟動子-1959bp to-1954bp區(qū)域結合;
　　3、免疫印跡和免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)當我們干擾了ZEB1后同時過表達hTERT后EMT發(fā)生了逆轉。過表達hTERT后E-cadhe

13、rin表達下降，N-cadherin和Vimentin表達上調。但是干擾掉ZEB1后E-cadherin恢復性調高，N-cadherin和Vimentin表達下調;
　　4、雙熒光素酶報告系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)在HCT116細胞中過表達hTERT后再干擾ZEB1，E-caderin啟動子活性有所回復;
　　5、染色免疫共沉淀實驗分析發(fā)現(xiàn)過表達hTERT后，hTERT與E-cadherin啟動子的結合增加，但是當我們干擾了ZEB1后hTER

14、T與E-cadherin的啟動子結合降低;
　　6、免疫印跡檢測到到在SW480細胞里過表達hTERT后ZEB1的表達上調，但是在HCT116細胞里并沒有發(fā)現(xiàn)ZEB1的變化;
　　7、Transwell穿膜和劃痕實驗發(fā)現(xiàn)在HCT116細胞中過表達hTERT后細胞的遷移能力明顯提高(p＜0.01)，但是干擾了ZEB1后細胞的遷移能力顯著下調。裸鼠尾靜脈注射實驗發(fā)現(xiàn)過表達hTERT可以促進腫瘤細胞的肺轉移，但是干擾了ZEB1后腫

15、瘤細胞的肺轉移明顯下調。
　　結論:
　　1、本研究首次證實了hTERT可以通過EMT促進結腸癌的轉移。我們也發(fā)現(xiàn)了hTERT通過新的路徑促進腫瘤EMT的發(fā)生。在這個研究中我們發(fā)現(xiàn)hTERT可以抑制 E-cadherin的表達，同時又促進了N-cadherin和Vimentin的表達。進一步深入研究發(fā)現(xiàn)hTERT可以抑制E-cadherin啟動子的活性來誘導EMT的發(fā)生，而在HCT116細胞中這條通路是獨立于Wnt信號通路的

16、，盡管在其它腫瘤中hTERT是通過Wnt這條經(jīng)典信號通路來促進EMT的發(fā)生的。這個結果為hTERT促進腫瘤轉移的機制補充了新的理論;
　　2、在這個研究的基礎上我們發(fā)現(xiàn)了hTERT可以通過EMT促進結腸癌細胞的轉移。其機制就是hTERT可以與ZEB1相互作用形成一個蛋白復合體，然后與E-cadherin的啟動子結合抑制E-cadherin的表達，從而促進EMT的發(fā)生。綜上所述我們首次證明了hTERT/ZEB1蛋白復合體的存在并結合