新型ARB洗脫支架防治支架再狹窄的實驗研究及ILKAPs克隆與功能研究.pdf

1、背景:
　　經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(PCI)是目前治療冠心病的重要方法，但術(shù)后再狹窄問題有待解決。新生內(nèi)膜過度生長是再狹窄的主要原因，與血管平滑肌細胞的過度增殖及分泌細胞外基質(zhì)有關(guān)。血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑(ARB)能抑制內(nèi)膜增殖，可能是一種新的藥物選擇。藥物涂層支架(DES)是目前治療PCI后再狹窄的主要方法，常用DES包括雷帕霉素涂層支架(SES)和紫杉醇涂層支架(PES)。兩類支架并不能完全消除再狹窄，還會帶來支架內(nèi)血栓形成

2、。改進支架設(shè)計、材料、涂層，尋找更合適的藥物是解決上述問題的途徑。結(jié)合血管支架使用基因治療來調(diào)節(jié)局部組織細胞功能是一個潛在的方法，但是有關(guān)的影響因素和分子機理是該方法進入臨床研究前必須明確的問題。
　　目的:
　　為指導(dǎo)臨床改進DES用藥，我們比較血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑纈沙坦與替米沙坦對離體人主動脈平滑肌細胞(HASMCs)增殖及膠原分泌的影響并探討其可能的機制。進一步通過動物實驗探討替米沙坦涂層、纈沙坦涂層和雷帕霉素支

3、架對支架術(shù)后內(nèi)膜增殖的作用差別。探討影響轉(zhuǎn)基因表達的蛋白sp100的相互作用蛋白，并對可能影響血管支架局部細胞反應(yīng)的ILKAPs進行基因克隆和功能研究。
　　材料與方法:
　　比較不同濃度的及條件的AngⅡ、纈沙坦、替米沙坦、GW9662干預(yù)HASMCs的效果。觀察處理后細胞增殖能力，細胞上清中Ⅰ、Ⅲ型膠原含量，細胞AT1、AT2受體蛋白表達，Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA水平。進一步選取28只實驗用豬，隨機置入替米沙坦涂層(TES)

4、、纈沙坦涂層(VES)、雷帕霉素支架(SES)和高分子涂層支架(PES)。分別于1周、1月和3月分別處死，處死前進行冠狀動脈造影(CAG)、光學(xué)相干成像(OCT)檢查。通過酵母雜交分析影響基因治療效果的SP100的相互作用蛋白組成。從中選取可能影響局部細胞增殖的ILKAP作表達譜，基因結(jié)構(gòu)和異構(gòu)體組成分析。并且通過亞細胞定位、過表達與低調(diào)表達對細胞增殖和凋亡的影響來探討ILKAPs的功能。
　　結(jié)果:
　　纈沙坦及替米沙坦均

5、可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的HASMCs增殖。替米沙坦的抑制作用較纈沙坦強。纈沙坦及替米沙坦均可抑制AT1受體、促進AT2受體表達，替米沙坦促進AT2受體表達能力更強。纈沙坦及替米沙坦均抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達，替米沙坦抑制Ⅲ型膠原能力較纈沙坦更強。PPAR-γ抑制劑GW9662可拮抗吡格列酮對HASMCs增殖的抑制作用，但對替米沙坦抑制HASMCs增殖的作用無明顯影響。纈沙坦及替米沙坦對HASMCsⅠ、Ⅲ型膠原的分泌無明顯影響。

6、　　動物實驗1周組共5只豬，隨訪支架13枚。TES、VES、SES和PES較BMS直徑狹窄率低。1月組共12只豬，隨訪支架29枚。CAG結(jié)果顯示TES、VES、SES和PES間MLD和直徑狹窄率均有明顯差異，其中TES、VES、SES的MLD明顯高于PES，直徑狹窄率明顯低于PES; TES、VES的MLD低于SES，并且TES的MLD高于VES; TES、VES的直徑狹窄率高于SES，并且TES的直徑狹窄率明顯低于VES。OCT檢查結(jié)

7、果顯示TES、VES、SES的新生內(nèi)膜厚度明顯低于PES，面積狹窄率明顯低于PES，TES、VES的新生內(nèi)膜厚度高于SES，并且TES的新生內(nèi)膜厚度明顯低于VES; TES、VES的面積狹窄率高于SES，并且TES的面積狹窄率明顯低于VES。3月組共11只豬，隨訪支架31枚。CAG結(jié)果顯示TES、VES、SES和PES間MLD和直徑狹窄率均有明顯差異，其中TES、VES、SES的MLD明顯高于PES，直徑狹窄率明顯低于PES; TES、

8、VES的MLD低于SES，并且TES的MLD高于VES; TES、VES的直徑狹窄率高于SES，并且TES的直徑狹窄率明顯低于VES。OCT檢查結(jié)果顯示TES、VES、SES的新生內(nèi)膜厚度明顯低于PES，面積狹窄率明顯低于PES，TES、VES的新生內(nèi)膜厚度高于SES，并且TES的新生內(nèi)膜厚度明顯低于VES; TES面積狹窄率低于SES和VES。
　　酵母雜交分離到64個潛在的SP100相互作用克隆。其中有ILKAP的一個新異構(gòu)體

9、出現(xiàn)兩次。使用ILKAP ORF特異性引物，我們擴增胎腦cDNA文庫，從中分離到3個異構(gòu)體:ILKAP1，ILKAP2和ILKAP3。其中ILKAP1含有兩個磷酸酶活性域，ILKAP3含有一個磷酸酶活性域，而ILKAP2僅僅只有一個N端結(jié)構(gòu)域，沒有磷酸酶活性域。掃描多組織cDNA pannels發(fā)現(xiàn)ILKAP2和ILKAP3僅僅在胎腦有較高水平表達。ILKAP3也見于表達于人類心臟。亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)ILKAP1-3均定位于細胞質(zhì)，與I

10、LK具有細胞內(nèi)共分布特性。提示其存在相互作用的空間可能性。免疫共沉淀分析發(fā)現(xiàn)抗GFP的抗體可以沉淀同時表達GFP-ILK的細胞中的三種ILKAPs。過表達ILKAP1、3可以導(dǎo)致細胞劃痕愈合時間延長。使用ILKAP特異性shRNA低調(diào)細胞ILKAP表達則可以加快劃痕愈合。
　　結(jié)論:
　　替米沙坦具有比纈沙坦更強的抑制HASMCs增殖、抑制Ⅲ型膠原基因表達及促進AT2受體表達上調(diào)的作用。
　　TES在抑制內(nèi)膜增殖方面與